Molekyylibiologisilla tutkimusmenetelmillä on suuri rooli modernissa lääketieteessä, oikeuslääketieteessä ja biologiassa. DNA:n ja RNA:n tutkimuksen edistymisen ansiosta ihminen pystyy tutkimaan organismin genomia, määrittämään taudin aiheuttajan, tunnistamaan halutun nukleiinihapon happoseoksesta jne.
Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät. Mikä se on?
Jos 70- ja 80-luvuilla tiedemiehet onnistuivat ensimmäistä kertaa selvittämään ihmisen genomin. Tämä tapahtuma antoi sysäyksen geenitekniikan ja molekyylibiologian kehitykselle. DNA:n ja RNA:n ominaisuuksien tutkiminen on johtanut siihen, että näitä nukleiinihappoja on nyt mahdollista käyttää sairauden diagnosoimiseen, geenien tutkimiseen.
DNA:n ja RNA:n hankkiminen
Molekyylibiologiset diagnostiset menetelmät edellyttävät lähtöaineen läsnäoloa: useammin se on nukleiinihappoa. On olemassa useita tapoja eristää nämä aineet elävien organismien soluista. Jokaisella niistä on omat etunsa ja haittansa, ja se on välttämätöntäota huomioon valitessasi menetelmää puhtaiden nukleiinihappojen eristämiseksi.
1. DNA:n saaminen Marmurin mukaan. Menetelmä koostuu aineseoksen käsittelystä alkoholilla, jonka seurauksena puhdas DNA saostuu. Tämän menetelmän haittana on aggressiivisten aineiden käyttö: fenoli ja kloroformi.
2. DNA:n eristäminen Boomin mukaan. Pääasiallinen tässä käytetty aine on guanidiinitiosyanaatti (GuSCN). Se edistää deoksiribonukleiinihapon saostumista erikoistuneille substraateille, joista se voidaan myöhemmin kerätä erityisellä puskurilla. GuSCN on kuitenkin PTC:n estäjä, ja jopa pieni osa siitä, joka joutuu saostuneeseen DNA:han, voi vaikuttaa polymeraasiketjureaktion etenemiseen, jolla on tärkeä rooli nukleiinihappojen kanssa työskentelyssä.
3. Epäpuhtauksien sedimentaatio. Menetelmä eroaa aikaisemmista siinä, että deoksiribonukleiinihapon molekyylit eivät saostu, vaan epäpuhtaudet. Tätä varten käytetään ioninvaihtimia. Haittana on, että kaikki aineet eivät voi saostua.
4. Joukkoseulonta. Tätä menetelmää käytetään tapauksissa, joissa tarkkaa tietoa DNA-molekyylin koostumuksesta ei tarvita, mutta on tarpeen hankkia joitain tilastotietoja. Tämä selittyy sillä, että nukleiinihapon rakenne voi vaurioitua, kun sitä käsitellään pesuaineilla, erityisesti emäksillä.
Tutkimusmenetelmien luokittelu
Kaikki molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät on jaettu kolmeen suureen ryhmään:
1. Monistaminen (käyttämällä monia entsyymejä). Tässäviittaa PCR-polymeraasiketjureaktioon, jolla on suuri rooli monissa diagnostisissa menetelmissä.
2. Ei-vahvistava. Tämä menetelmäryhmä liittyy suoraan nukleiinihapposeosten toimintaan. Esimerkkejä ovat 3 blottia, in situ -hybridisaatio jne.
3. Menetelmät, jotka perustuvat signaalin tunnistamiseen koetinmolekyylistä, joka sitoutuu tiettyyn koetin-DNA:han tai RNA:han. Esimerkki on Hybride Capture System (hc2).
Entsyymit, joita voidaan käyttää molekyylibiologian tutkimusmenetelmissä
Monet molekyylidiagnostiset menetelmät sisältävät monenlaisia entsyymejä. Alla on yleisimmin käytetyt:
1. Restriktioentsyymi - "leikkaa" DNA-molekyylin tarvittaviin osiin.
2. DNA-polymeraasi - syntetisoi kaksijuosteisen deoksiribonukleiinihapon molekyylin.
3. Käänteistranskriptaasi (revertaasi) - käytetään DNA:n syntetisoimiseen RNA-templaatissa.
4. DNA-ligaasi - vastaa fosfodiesterisidosten muodostumisesta nukleotidien välillä.
5. Eksonukleaasi - poistaa nukleotidit deoksiribonukleiinihappomolekyylin terminaalisista osista.
PCR on tärkein DNA-monistuksen menetelmä
Polymeraasiketjureaktiota (PCR) käytetään aktiivisesti nykyaikaisessa molekyylibiologiassa. Tämä on menetelmä, jolla yhdestä DNA-molekyylistä voidaan saada v altava määrä kopioita (molekyylejä monistetaan).
PCR:n päätoiminnot:
- diagnostiikkasairaudet;
- DNA-segmenttien, geenien kloonaus.
Seuraavia elementtejä tarvitaan polymeraasiketjureaktion suorittamiseen: alkuperäinen DNA-molekyyli, lämpöstabiili DNA-polymeraasi (Taq tai Pfu), deoksiribonukleotidifosfaatit (typpipitoisten emästen lähteet), alukkeet (2 aluketta per 1 DNA-molekyyli) ja itse puskurijärjestelmä, jossa kaikki reaktiot ovat mahdollisia.
PCR koostuu kolmesta vaiheesta: denaturaatiosta, alukkeen pariutumisesta ja elongaatiosta.
1. Denaturaatio. 94-95 celsiusasteen lämpötilassa kahden DNA-juosteen väliset vetysidokset katkeavat ja tuloksena saadaan kaksi yksijuosteista molekyyliä.
2. Primer hehkutus. 50-60 celsiusasteen lämpötilassa alukkeet kiinnittyvät yksijuosteisten nukleiinihappomolekyylien päihin komplementaarisuuden tyypin mukaan.
3. Pidentymä. 72 asteen lämpötilassa tapahtuu deoksiribonukleiinihapon kaksijuosteisten tytärmolekyylien synteesi.
DNA-sekvensointi
Molekyylibiologiset tutkimusmenetelmät vaativat usein tietoa deoksiribonukleiinihappomolekyylin nukleotidisekvenssistä. Sekvensointi suoritetaan geneettisen koodin määrittämiseksi. Tulevaisuuden molekyylidiagnostiikka perustuu ihmisen sekvensoinnista saatuun tietoon.
Seuraavat sekvensointityypit erotellaan:
- Maxam-Gilbert-sekvensointi;
- Sanger-sekvensointi;
- pyrosekvensointi;
- nanoporesekvensointi.
