Proteiini on kaikkien organismien olennainen osa. Jokainen sen molekyyli koostuu yhdestä tai useammasta polypeptidiketjusta, joka koostuu aminohapoista. Vaikka elämälle välttämätön tieto on koodattu DNA:han tai RNA:han, rekombinanttiproteiinit suorittavat organismeissa monenlaisia biologisia toimintoja, mukaan lukien entsymaattinen katalyysi, suojaus, tuki, liike ja säätely. Nämä aineet voidaan jakaa kehossa toimivien toimintojensa mukaan eri luokkiin, kuten vasta-aineet, entsyymit, rakennekomponentit. Tärkeiden toimintojensa vuoksi tällaisia yhdisteitä on tutkittu intensiivisesti ja käytetty laaj alti.
Aiemmin pääasiallinen tapa saada rekombinanttiproteiini oli eristää se luonnollisesta lähteestä, mikä on yleensä tehotonta ja aikaa vievää. Biologisen molekyyliteknologian viimeaikaiset edistysaskeleet ovat tehneet mahdolliseksi kloonata tiettyä ainetta koodaavan DNA:n ekspressiovektoriksi sellaisille aineille kuin bakteerit, hiiva, hyönteissolut ja nisäkässolut.
Yksinkertaisesti sanottuna, rekombinanttiproteiinit muunnetaan eksogeenisten DNA-tuotteiden avullaelävät solut. Niiden hankkiminen sisältää yleensä kaksi päävaihetta:
- Molekyylin kloonaus.
- Proteiinin ilmentyminen.
Tällaisen rakenteen valmistaminen on tällä hetkellä yksi tehokkaimmista lääketieteen ja biologian menetelmistä. Koostumuksella on laaja sovellus tutkimuksessa ja biotekniikassa.
Lääketieteen suunta
Rekombinanttiproteiinit tarjoavat tärkeitä hoitomuotoja eri sairauksiin, kuten diabetekseen, syöpään, infektiosairauksiin, hemofiliaan ja anemiaan. Tyypillisiä tällaisten aineiden formulaatioita ovat vasta-aineet, hormonit, interleukiinit, entsyymit ja antikoagulantit. Terapeuttiseen käyttöön tarkoitettujen rekombinanttiformulaatioiden tarve kasvaa. Niiden avulla voit laajentaa hoitomenetelmiä.
geneettisesti muokatuilla rekombinanttiproteiineilla on keskeinen rooli terapeuttisten lääkeaineiden markkinoilla. Nisäkässolut tuottavat tällä hetkellä eniten terapeuttisia aineita, koska niiden formulaatiot pystyvät tuottamaan korkealaatuisia, luonnollisen k altaisia aineita. Lisäksi E. colissa tuotetaan monia hyväksyttyjä terapeuttisia rekombinanttiproteiineja hyvän genetiikan, nopean kasvun ja korkean tuottavuuden ansiosta. Sillä on myös myönteinen vaikutus tähän aineeseen perustuvien lääkkeiden kehitykseen.
Tutkimus
Rekombinanttiproteiinien saaminen perustuu erilaisiin menetelmiin. Aineet auttavat selvittämään kehon perus- ja perusperiaatteet. Näitä molekyylejä voidaan käyttää tunnistamiseen ja määrittämiseentietyn geenin koodaaman aineen sijainti ja paljastaa muiden geenien toiminnan erilaisissa solun toiminnoissa, kuten solujen signaloinnissa, aineenvaihdunnassa, kasvussa, replikaatiossa ja kuolemassa, transkriptiossa, translaatiossa ja artikkelissa käsiteltyjen yhdisteiden muuntamisessa.
Näin havaittua koostumusta käytetään usein molekyylibiologiassa, solubiologiassa, biokemiassa, rakenne- ja biofysikaalisissa tutkimuksissa ja monilla muilla tieteenaloilla. Samaan aikaan rekombinanttiproteiinien saaminen on kansainvälinen käytäntö.
Tällaiset yhdisteet ovat hyödyllisiä työkaluja solujen välisten vuorovaikutusten ymmärtämisessä. Ne ovat osoittautuneet tehokkaiksi useissa laboratoriomenetelmissä, kuten ELISA:ssa ja immunohistokemiassa (IHC). Rekombinanttiproteiineja voidaan käyttää kehittämään entsyymimäärityksiä. Kun soluja käytetään yhdessä parin sopivan vasta-aineen kanssa, niitä voidaan käyttää uusien teknologioiden standardeina.
Biotekniikka
Aminohapposekvenssin sisältäviä rekombinanttiproteiineja käytetään myös teollisuudessa, elintarviketuotannossa, maataloudessa ja biotekniikassa. Esimerkiksi karjanhoidossa entsyymejä voidaan lisätä elintarvikkeisiin lisäämään rehun ainesosien ravintoarvoa, vähentämään kustannuksia ja jätettä, tukemaan eläinten suoliston terveyttä, parantamaan tuottavuutta ja parantamaan ympäristöä.
Lisäksi maitohappobakteerit (LAB) pitkäänon käytetty fermentoitujen elintarvikkeiden valmistukseen, ja äskettäin LAB on kehitetty aminohapposekvenssin sisältävien rekombinanttiproteiinien ilmentämiseen, jota voidaan käyttää laajasti esimerkiksi ihmisten, eläinten ja ravitsemuksellisen ruoansulatuksen parantamiseen.
Näillä aineilla on kuitenkin myös rajoituksia:
- Joissakin tapauksissa rekombinanttiproteiinien tuotanto on monimutkaista, kallista ja aikaa vievää.
- Soluissa tuotetut aineet eivät välttämättä vastaa luonnollisia muotoja. Tämä ero voi vähentää terapeuttisten rekombinanttiproteiinien tehokkuutta ja jopa aiheuttaa sivuvaikutuksia. Lisäksi tämä ero voi vaikuttaa kokeiden tuloksiin.
- Kaikkien rekombinanttilääkkeiden pääongelma on immunogeenisyys. Kaikilla bioteknologian tuotteilla voi olla jonkinlaista immunogeenisuutta. Uusien terapeuttisten proteiinien turvallisuutta on vaikea ennustaa.
Yleensä biotekniikan kehitys on lisännyt ja helpottanut rekombinanttiproteiinien tuotantoa erilaisiin sovelluksiin. Vaikka niillä on edelleen joitain haittoja, ne ovat tärkeitä lääketieteessä, tutkimuksessa ja biotekniikassa.
Tautilinkki
rekombinanttiproteiini ei ole haitallista ihmisille. Se on vain olennainen osa kokonaismolekyyliä tietyn lääkkeen tai ravintoelementin kehittämisessä. Monet lääketieteelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että FGFBP3-proteiinin (lyhennetty BP3) pakkoekspressio lihavien hiirten laboratoriokannassa osoitti niiden kehon rasvan merkittävää vähenemistä.massa, huolimatta geneettisestä käyttö alttiudesta.
Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että FGFBP3-proteiini voi tarjota uuden hoidon metaboliseen oireyhtymään liittyviin sairauksiin, kuten tyypin 2 diabetekseen ja rasvamaksasairauksiin. Mutta koska BP3 on luonnollinen proteiini eikä keinotekoinen lääke, ihmisen rekombinantin BP3:n kliiniset tutkimukset voitaisiin aloittaa viimeisen prekliinisen tutkimuksen jälkeen. On, eli on olemassa syitä, jotka liittyvät tällaisten tutkimusten suorittamisen turvallisuuteen. Yhdistelmäproteiini ei ole haitallinen ihmisille sen vaiheittaisen käsittelyn ja puhdistuksen ansiosta. Muutoksia tapahtuu myös molekyylitasolla.
PD-L2, yksi immunoterapian avaintoimijoista, oli ehdolla vuoden 2018 fysiologian tai lääketieteen Nobel-palkinnon saajaksi. Tämä amerikkalaisen professori James P. Allisonin ja japanilaisen professori Tasuku Honjon aloittama työ on johtanut syöpien, kuten melanooman, keuhkosyövän ja muiden syöpien hoitoon tarkistuspisteimmunoterapian pohj alta. Äskettäin AMSBIO on lisännyt immunoterapiasarjaansa merkittävän uuden tuotteen, PD-L2/TCR-aktivaattorin - CHO Recombinant Cell Line -solulinjan.
Alabaman yliopiston Birminghamissa tutkijat, professori Robert B. Adams ja laboratoriolääketieteen johtaja, patologian osasto, Birminghamissa sijaitsevan Alabaman yliopiston tutkijat ja laboratorion lääketieteen johtaja, patologian osasto, Birminghamissa. Lääketiede on tuonut esiin harvinaisen mutta kuolemaan johtavan verenvuotohäiriön, TTP:n, mahdollisen hoidon.
Tämän tuloksettutkimukset osoittavat ensimmäistä kertaa, että rADAMTS13-kuormitettujen verihiutaleiden siirto voi olla uusi ja mahdollisesti tehokas terapeuttinen lähestymistapa synnynnäiseen ja immuunivälitteiseen TTP:hen liittyvään v altimotromboosiin.
Rekombinanttiproteiini ei ole vain ravintoaine, vaan myös lääkeaine kehitettävän lääkkeen koostumuksessa. Nämä ovat vain muutamia alueita, jotka liittyvät nyt lääketieteeseen ja liittyvät sen kaikkien rakenneosien tutkimukseen. Kuten kansainvälinen käytäntö osoittaa, aineen rakenne mahdollistaa molekyylitasolla monien ihmiskehon vakavien ongelmien käsittelemisen.
Rokotteiden kehittäminen
Rekombinanttiproteiini on tietty joukko molekyylejä, joita voidaan mallintaa. Samanlaista ominaisuutta käytetään rokotteiden kehittämisessä. Edinburghin yliopiston ja Pirbright-instituutin tutkijat sanoivat, että uusi rokotusstrategia, joka tunnetaan myös erityisenä rekombinanttivirusinjektiona, voisi suojata miljoonia vaarassa olevia kanoja vakav alta hengityselinsairauksilta. Nämä rokotteet käyttävät vaarattomia tai heikkoja versioita viruksesta tai bakteerista tuomaan bakteereita kehon soluihin. Tässä tapauksessa asiantuntijat käyttivät rekombinanttiviruksia, joissa oli erilaisia piikkiproteiineja, rokotteina luodakseen kaksi versiota vaarattomasta viruksesta. Tämän yhteyden ympärille on rakennettu monia erilaisia lääkkeitä.
Rekombinanttiproteiinien kauppanimet ja analogit ovat seuraavat:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Nämä ovat pääasiassa syöpälääkkeitä, mutta tähän vaikuttavaan aineeseen liittyy muitakin hoitoalueita.
Uusi rokote, jota kutsutaan myös nimellä LASSARAB, joka on suunniteltu suojaamaan ihmisiä sekä Lassa-kuumetta että rabiesta vastaan, on osoittanut lupaavia tuloksia prekliinisissä tutkimuksissa Nature Communications -tiedelehdessä julkaistun uuden tutkimuksen mukaan. Inaktivoitu rekombinanttirokoteehdokas käyttää heikennettyä rabiesvirusta.
Tutkijaryhmä lisäsi Lassa-viruksen geneettistä materiaalia rabiesvirusvektoriin, jotta rokote ilmentäisi pintaproteiineja sekä Lassa- että rabiessoluissa. Nämä pintayhdisteet saavat aikaan immuunivasteen tartunta-aineita vastaan. Tämä rokote inaktivoitiin sitten "tuhottamaan" kantajan valmistukseen käytetyn elävän rabiesviruksen.
Menetelmien hankkiminen
Aineen tuottamiseen on olemassa useita järjestelmiä. Yleinen menetelmä rekombinanttiproteiinin saamiseksi perustuu biologisen materiaalin saamiseen synteesistä. Mutta on muitakin tapoja.
Tällä hetkellä on viisi päälausekejärjestelmää:
- E. coli -ekspressiojärjestelmä.
- Hiivailmentymisjärjestelmä.
- Hyönteissolujen ilmentämisjärjestelmä.
- Nisäkässolujen ilmentymisjärjestelmä.
- Soluton proteiiniekspressiojärjestelmä.
Jälkimmäinen vaihtoehto sopii erityisen hyvin transmembraanisten proteiinien ilmentämiseenja myrkyllisiä yhdisteitä. Viime vuosina aineita, joita on vaikea ilmentää tavanomaisilla solunsisäisillä menetelmillä, on onnistuneesti integroitu soluihin in vitro. Valko-Venäjällä rekombinanttiproteiinien tuotantoa käytetään laaj alti. Useat v altion omistamat yritykset käsittelevät tätä asiaa.
Cell Free Protein Synthesis System on nopea ja tehokas menetelmä kohdeaineiden syntetisoimiseen lisäämällä erilaisia substraatteja ja energiayhdisteitä, joita tarvitaan transkriptioon ja translaatioon soluuutteiden entsymaattisessa järjestelmässä. Viime vuosina soluttomien menetelmien edut erityyppisille aineille, kuten monimutkaisille, myrkyllisille kalvoille, ovat vähitellen tulleet esiin, mikä osoittaa niiden mahdollisen käytön biofarmaseuttisella alalla.
Soluton teknologia voi lisätä erilaisia ei-luonnollisesti esiintyviä aminohappoja helposti ja kontrolloidusti monimutkaisten muunnosprosessien aikaansaamiseksi, joita on vaikea ratkaista tavanomaisen rekombinanttiekspression jälkeen. Tällaisilla menetelmillä on korkea sovellusarvo ja potentiaali lääkkeiden kuljettamiseen ja rokotteiden kehittämiseen käyttämällä viruksen k altaisia partikkeleita. Suuri määrä kalvoproteiineja on ekspressoitu onnistuneesti vapaissa soluissa.
Sävellysten ilmaisu
Rekombinanttiproteiini CFP10-ESAT 6 valmistetaan ja sitä käytetään rokotteiden luomiseen. Tällainen tuberkuloosiallergeeni antaa sinun vahvistaa immuunijärjestelmää ja kehittää vasta-aineita. Yleensä molekyylitutkimukset sisältävät proteiinin minkä tahansa näkökohdan, kuten rakenteen, toiminnan, modifikaatioiden, lokalisoinnin tai vuorovaikutusten, tutkimuksen. Tutkiakuinka tietyt aineet säätelevät sisäisiä prosesseja, tutkijat tarvitsevat yleensä keinoja tuottaa kiinnostavia ja hyödyllisiä funktionaalisia yhdisteitä.
Proteiinien koon ja monimutkaisuuden vuoksi kemiallinen synteesi ei ole toteuttamiskelpoinen vaihtoehto tälle yritykselle. Sen sijaan eläviä soluja ja niiden solukoneita käytetään yleensä tehtaina luomaan ja rakentamaan aineita toimitettujen geneettisten mallien perusteella. Rekombinanttiproteiinin ilmentämisjärjestelmä luo sitten tarvittavan rakenteen lääkkeen luomiseksi. Seuraavaksi valitaan tarvittava materiaali eri lääkekategorioihin.
Toisin kuin proteiineja, DNA on helppo rakentaa synteettisesti tai in vitro käyttäen vakiintuneita rekombinanttitekniikoita. Siksi spesifisten geenien DNA-templaatit, lisättyjen reportterisekvenssien tai affiniteettimerkkisekvenssien kanssa tai ilman niitä, voidaan suunnitella templaatteiksi seurattavan aineen ilmentymistä varten. Tällaisia tällaisista DNA-templaateista johdettuja yhdisteitä kutsutaan rekombinanttiproteiineiksi.
Perinteiset strategiat aineen ilmentämiseksi sisältävät solujen transfektoimisen DNA-vektorilla, joka sisältää templaatin, ja sitten solujen viljelemisen halutun proteiinin transkriptoimiseksi ja kääntämiseksi. Tyypillisesti solut lyysataan sitten ilmennetyn yhdisteen uuttamiseksi myöhempää puhdistusta varten. Rekombinanttiproteiini CFP10-ESAT6 käsitellään tällä tavalla ja kulkee puhdistusjärjestelmän läpi mahdollisistatoksiinien muodostumista. Vasta sen jälkeen se syntetisoidaan rokotteeksi.
Sekä prokaryoottisia että eukaryoottisia in vivo -ekspressiojärjestelmiä molekyyliaineille käytetään laaj alti. Järjestelmän valinta riippuu proteiinin tyypistä, toiminnallisen aktiivisuuden vaatimuksesta ja halutusta saannosta. Näihin ilmentämisjärjestelmiin kuuluvat nisäkkäät, hyönteiset, hiivat, bakteerit, levät ja solut. Jokaisella järjestelmällä on omat etunsa ja haasteensa, ja oikean järjestelmän valinta tiettyyn sovellukseen on tärkeää tarkasteltavan aineen onnistuneen ilmaisun kann alta.
Nisäkkäiden ilmaisu
Rekombinanttiproteiinien käyttö mahdollistaa eritasoisten rokotteiden ja lääkkeiden kehittämisen. Tätä varten voidaan käyttää tätä menetelmää aineen saamiseksi. Nisäkkään ilmentämisjärjestelmiä voidaan käyttää tuottamaan eläinkunnasta peräisin olevia proteiineja, joilla on luonnollisin rakenne ja aktiivisuus fysiologisesti merkityksellisestä ympäristöstään johtuen. Tämä johtaa korkeaan translaation jälkeiseen prosessointiin ja toiminnalliseen toimintaan. Nisäkkään ilmentämisjärjestelmiä voidaan käyttää tuottamaan vasta-aineita, kompleksisia proteiineja ja yhdisteitä käytettäväksi solupohjaisissa toiminnallisissa määrityksissä. Nämä edut yhdistetään kuitenkin tiukempien viljelyolosuhteiden kanssa.
Nisäkkäiden ilmentämisjärjestelmiä voidaan käyttää proteiinien tuottamiseen ohimenevästi tai stabiilien solulinjojen kautta, joissa ekspressiokonstrukti on integroitu isäntägenomiin. Vaikka tällaisia järjestelmiä voidaan käyttää useissa kokeissa, aikatuotanto voi tuottaa suuren määrän ainetta yhdessä tai kahdessa viikossa. Tämän tyyppisellä rekombinanttiproteiinibiotekniikalla on suuri kysyntä.
Nämä ohimenevät, korkeasatoiset nisäkäsekspressiojärjestelmät käyttävät suspensioviljelmiä ja voivat tuottaa grammaa litraa kohti. Lisäksi näissä proteiineissa on enemmän natiivia laskostumista ja translaation jälkeisiä modifikaatioita, kuten glykosylaatiota, verrattuna muihin ekspressiojärjestelmiin.
Hyönteisten ilme
Menetelmät rekombinanttiproteiinin tuottamiseksi eivät rajoitu nisäkkäisiin. Tuotantokustannusten kann alta on myös tuottavampia tapoja, vaikka aineen saanto 1 litraa käsiteltyä nestettä kohden on paljon pienempi.
Hyönteissoluja voidaan käyttää korkean tason proteiinin ilmentämiseen nisäkässysteemien k altaisilla modifikaatioilla. On olemassa useita järjestelmiä, joita voidaan käyttää rekombinanttibaculoviruksen tuottamiseen, jota voidaan sitten käyttää kiinnostavan aineen uuttamiseen hyönteissoluista.
Rekombinanttiproteiinien ilmentymiä voidaan helposti skaalata ja mukauttaa suuritiheyksiseen suspensioviljelmään molekyylien laajamittaista yhdistämistä varten. Ne ovat toiminnallisesti samanlaisia kuin nisäkäsaineen luontainen koostumus. Vaikka saanto voi olla jopa 500 mg/l, rekombinantin bakuloviruksen tuotanto voi olla aikaa vievää ja viljelyolosuhteet ovat vaikeampia kuin prokaryoottijärjestelmät. Kuitenkin eteläisemmissä ja lämpimämmissä maissa samanlainenmenetelmää pidetään tehokkaampana.
Bakteereiden ilmentyminen
Rekombinanttiproteiinien tuotanto voidaan saada aikaan bakteerien avulla. Tämä tekniikka eroaa paljon edellä kuvatuista. Bakteeriproteiinien ilmentämisjärjestelmät ovat suosittuja, koska bakteereja on helppo viljellä, ne kasvavat nopeasti ja antavat korkeat saannot rekombinanttiformulaatiosta. Bakteereissa ilmentyvät monidomeeniset eukaryoottiset aineet ovat kuitenkin usein epätoiminnallisia, koska solut eivät ole varustettuja suorittamaan tarvittavia translaation jälkeisiä modifikaatioita tai molekyylien laskostumista.
Lisäksi monet proteiinit muuttuvat liukenemattomiksi inkluusiomolekyyleiksi, joita on erittäin vaikea saada t alteen ilman kovia denaturoivia aineita ja niitä seuraavia hankalia molekyylien uudelleenlaskostusmenetelmiä. Tätä menetelmää pidetään enimmäkseen vielä suurelta osin kokeellisena.
Soluvapaa ilmaisu
Rekombinanttiproteiini, joka sisältää stafylokinaasin aminohapposekvenssin, saadaan hieman eri tavalla. Se sisältyy monenlaisiin injektiotyyppeihin, jotka vaativat useita järjestelmiä ennen käyttöä.
Soluvapaa proteiiniekspressio on aineen in vitro -synteesi käyttämällä translaation kann alta yhteensopivia kokosoluuutteita. Periaatteessa kokosoluuutteet sisältävät kaikki makromolekyylit ja komponentit, joita tarvitaan transkriptioon, translaatioon ja jopa translaation jälkeiseen modifiointiin.
Näihin komponentteihin kuuluvat RNA-polymeraasi, säätelevät proteiinitekijät, transkriptiomuodot, ribosomit ja tRNA. Lisättäessäkofaktorit, nukleotidit ja spesifinen geenitemplaatti, nämä uutteet voivat syntetisoida kiinnostavia proteiineja muutamassa tunnissa.
Vaikkakaan ei kestä laajamittaista tuotantoa, soluttomat tai in vitro -proteiinin ilmentämisjärjestelmät (IVT) tarjoavat useita etuja perinteisiin in vivo -järjestelmiin verrattuna.
Soluton ekspressio mahdollistaa rekombinanttiformulaatioiden nopean synteesin ilman soluviljelmää. Soluttomat järjestelmät mahdollistavat proteiinien leimaamisen modifioiduilla aminohapoilla sekä sellaisten yhdisteiden ilmentämisen, jotka läpikäyvät nopean proteolyyttisen hajoamisen solunsisäisten proteaasien vaikutuksesta. Lisäksi on helpompi ekspressoida useita eri proteiineja samanaikaisesti soluvapaalla menetelmällä (esimerkiksi testaamalla proteiinimutaatioita pienimuotoisella ilmennyksellä useista erilaisista yhdistelmä-DNA-templaateista). Tässä edustavassa kokeessa IVT-järjestelmää käytettiin ihmisen kaspaasi-3-proteiinin ilmentämiseen.
Johtopäätökset ja tulevaisuudennäkymät
Rekombinanttiproteiinituotantoa voidaan nyt pitää kypsänä tieteenalana. Tämä on seurausta lukuisista puhdistuksen ja analyysin asteittaisista parannuksista. Tällä hetkellä lääkekehitysohjelmat lopetetaan harvoin, koska kohdeproteiinia ei pystytä tuottamaan. Rinnakkaiset prosessit useiden rekombinanttien aineiden ilmentämiseksi, puhdistamiseksi ja analysoimiseksi tunnetaan nyt hyvin monissa laboratorioissa ympäri maailmaa.
Proteiinikompleksit ja kasvava menestys valmistuksessaliuenneet kalvorakenteet vaativat lisää muutoksia pysyäkseen kysynnän tasalla. Tehokkaiden sopimustutkimusorganisaatioiden syntyminen säännöllisempään proteiinien saantiin mahdollistaa tieteellisten resurssien uudelleen kohdentamisen näihin uusiin haasteisiin vastaamiseksi.
Lisäksi rinnakkaisten työnkulkujen pitäisi mahdollistaa täydellisten kirjastojen luominen valvotusta aineesta uuden kohteen tunnistamisen ja edistyneen seulonnan mahdollistamiseksi perinteisten pienimolekyylisten lääkekehitysprojektien ohella.
