Immobilisoitujen entsyymien käsite syntyi ensimmäisen kerran 1900-luvun jälkipuoliskolla. Sillä välin, vuonna 1916, havaittiin, että hiileen sorboitunut sakkaroosi säilytti katalyyttisen aktiivisuutensa. Vuonna 1953 D. Schleit ja N. Grubhofer suorittivat pepsiinin, amylaasin, karboksipeptidaasin ja RNaasin ensimmäisen sitomisen liukenemattomalla kantajalla. Immobilisoitujen entsyymien käsite laillistettiin vuonna 1971. Tämä tapahtui ensimmäisessä teknisen entsymologian konferenssissa. Tällä hetkellä immobilisoitujen entsyymien käsitettä tarkastellaan laajemmassa merkityksessä kuin 1900-luvun lopulla. Katsotaanpa tätä luokkaa tarkemmin.
Yleistä tietoa
Immobilisoidut entsyymit ovat yhdisteitä, jotka on sidottu keinotekoisesti liukenemattomaan kantajaan. Ne säilyttävät kuitenkin katalyyttiset ominaisuutensa. Tällä hetkellä tätä prosessia tarkastellaan kahdessa suhteessa - proteiinimolekyylien liikkumisvapauden osittaisen ja täydellisen rajoittamisen puitteissa.
Arvollisuus
Tutkijat ovat osoittaneet tiettyjä immobilisoitujen entsyymien etuja. Heterogeenisinä katalyytteinä ne voidaan helposti erottaa reaktioväliaineesta. Osana tutkimusta todettiin, että immobilisoitujen entsyymien käyttö voidaan toistaa. Sidosprosessin aikana liitokset muuttavat ominaisuuksiaan. Ne saavuttavat substraattispesifisyyden ja stabiilisuuden. Samalla niiden toiminta alkaa riippua ympäristöolosuhteista. Immobilisoidut entsyymit ovat kestäviä ja niillä on korkea stabiilisuusaste. Se on tuhansia, kymmeniä tuhansia kertoja suurempi kuin esimerkiksi vapaiden entsyymien. Kaikki tämä varmistaa sellaisten teknologioiden korkean tehokkuuden, kilpailukyvyn ja taloudellisuuden, jossa immobilisoituja entsyymejä on läsnä.
Media
J. Poratu tunnisti immobilisaatiossa käytettävien ihanteellisten materiaalien keskeiset ominaisuudet. Kantajalla tulee olla:
- Liukenemattomuus.
- Korkea biologinen ja kemiallinen kestävyys.
- Mahdollisuus aktivoida nopeasti. Kantajista tulee helposti reagoimaan.
- Merkittävää hydrofiilisyyttä.
- Tarvittava läpäisevyys. Sen indikaattorin tulisi olla yhtä hyväksyttävä sekä entsyymeille että koentsyymeille, reaktiotuotteille ja substraateille.
Tällä hetkellä ei ole materiaalia, joka täyttäisi täysin nämä vaatimukset. Käytännössä kuitenkin käytetään immobilisointiin soveltuvia kantoaineita.tietyn luokan entsyymejä tietyissä olosuhteissa.
Luokittelu
Materiaalit, joiden yhteydessä yhdisteet muuttuvat immobilisoiduiksi entsyymeiksi, jaetaan luonteeltaan epäorgaanisiin ja orgaanisiin. Monien yhdisteiden sitominen suoritetaan polymeerisillä kantajilla. Nämä orgaaniset materiaalit on jaettu 2 luokkaan: synteettiset ja luonnolliset. Jokaisessa niistä puolestaan erotetaan ryhmät rakenteesta riippuen. Epäorgaanisia kantajia edustavat pääasiassa lasista, keramiikasta, savesta, silikageelistä ja grafiittimustista tehdyt materiaalit. Materiaalien kanssa työskennellessä kuivakemian menetelmät ovat suosittuja. Immobilisoituja entsyymejä saadaan päällystämällä kantoaineet titaani-, alumiini-, zirkonium-, hafniumoksidikalvolla tai prosessoimalla orgaanisilla polymeereillä. Materiaalien tärkeä etu on regeneroinnin helppous.
Proteiinin kantajat
Suosituimmat ovat lipidi-, polysakkaridi- ja proteiinimateriaalit. Jälkimmäisistä kannattaa korostaa rakenteellisia polymeerejä. Näitä ovat pääasiassa kollageeni, fibriini, keratiini ja gelatiini. Tällaiset proteiinit ovat laaj alti levinneitä luonnollisessa ympäristössä. Ne ovat edullisia ja taloudellisia. Lisäksi niissä on suuri määrä funktionaalisia ryhmiä sitoutumista varten. Proteiinit ovat biohajoavia. Tämä mahdollistaa immobilisoitujen entsyymien käytön laajentamisen lääketieteessä. Samaan aikaan proteiineilla on myös negatiivisia ominaisuuksia. Immobilisoitujen entsyymien käytön haittoja proteiinin kantajilla on viimeksi mainittujen korkea immunogeenisyys sekäkyky tuoda vain tiettyjä ryhmiä niistä reaktioihin.
Polysakkaridit, aminosakkaridit
Näistä materiaaleista käytetään useimmiten kitiiiniä, dekstraania, selluloosaa, agaroosia ja niiden johdannaisia. Jotta polysakkaridit olisivat vastustuskykyisempiä reaktioille, niiden lineaariset ketjut silloitetaan epikloorihydriinillä. Erilaisia ionogeenisiä ryhmiä tuodaan vapaasti verkkorakenteisiin. Kitiiniä kertyy suuria määriä jätteenä katkarapujen ja rapujen teollisen käsittelyn aikana. Tämä aine kestää kemikaaleja ja sillä on hyvin määritelty huokoinen rakenne.
Synteettiset polymeerit
Tämä materiaaliryhmä on hyvin monipuolinen ja helposti saatavilla. Se sisältää akryylihappoon, styreeniin, polyvinyylialkoholiin, polyuretaaniin ja polyamidipolymeereihin perustuvia polymeerejä. Suurin osa niistä on mekaanisesti vahvoja. Muutosprosessissa ne tarjoavat mahdollisuuden vaihdella huokoskokoa melko laajalla alueella, jolloin saadaan erilaisia funktionaalisia ryhmiä.
Sidontamenetelmät
Tällä hetkellä on olemassa kaksi täysin erilaista immobilisointivaihtoehtoa. Ensimmäinen on saada yhdisteitä, joissa ei ole kovalenttisia sidoksia kantajan kanssa. Tämä menetelmä on fyysinen. Toinen vaihtoehto sisältää kovalenttisen sidoksen muodostumisen materiaalin kanssa. Tämä on kemiallinen menetelmä.
Adsorptio
Sen avulla saadaan immobilisoituja entsyymejä pitämällä lääkettä kantajan pinnalladispersio, hydrofobinen, sähköstaattinen vuorovaikutus ja vetysidokset. Adsorptio oli ensimmäinen tapa rajoittaa elementtien liikkuvuutta. Tämä vaihtoehto ei kuitenkaan ole menettänyt merkitystään vielä nytkään. Lisäksi adsorptiota pidetään alan yleisimpana immobilisointimenetelmänä.
Menetelmän ominaisuudet
Tieteelliset julkaisut kuvaavat yli 70 entsyymiä, jotka on saatu adsorptiomenetelmällä. Kantajat olivat pääasiassa huokoista lasia, erilaisia savea, polysakkarideja, alumiinioksideja, synteettisiä polymeerejä, titaania ja muita metalleja. Jälkimmäiset ovat yleisimmin käytettyjä. Lääkkeen adsorption tehokkuus kantajaan määräytyy materiaalin huokoisuuden ja ominaispinta-alan mukaan.
Toimintamekanismi
Entsyymien adsorptio liukenemattomiin materiaaleihin on yksinkertaista. Se saavutetaan saattamalla lääkkeen vesiliuos kosketukseen kantajan kanssa. Se voi kulkea staattisella tai dynaamisella tavalla. Entsyymiliuos sekoitetaan tuoreeseen sedimenttiin, esimerkiksi titaanihydroksidiin. Sitten yhdiste kuivataan miedoissa olosuhteissa. Entsyymiaktiivisuus säilyy tällaisen immobilisoinnin aikana lähes 100 %. Samaan aikaan spesifinen pitoisuus saavuttaa 64 mg/gramma kantaja-ainetta.
Negatiiviset hetket
Adsorption haittoja ovat alhainen lujuus entsyymin ja kantajan sitomisessa. Reaktio-olosuhteiden muuttamisessa voidaan havaita elementtien häviäminen, tuotteiden saastuminen ja proteiinien desorptio. Vahvuuden parantamiseksisitovat kantajat ovat esimodifioituja. Erityisesti materiaaleja käsitellään metalli-ioneilla, polymeereillä, hydrofobisilla yhdisteillä ja muilla polyfunktionaalisilla aineilla. Joissakin tapauksissa itse lääkettä muutetaan. Mutta melko usein tämä johtaa sen toiminnan vähenemiseen.
Sisällytetään geeliin
Tämä vaihtoehto on melko yleinen ainutlaatuisuutensa ja yksinkertaisuutensa vuoksi. Tämä menetelmä ei sovellu vain yksittäisille elementeille, vaan myös monientsyymikomplekseille. Lisääminen geeliin voidaan tehdä kahdella tavalla. Ensimmäisessä tapauksessa lääke yhdistetään monomeerin vesiliuokseen, minkä jälkeen suoritetaan polymerointi. Tämän seurauksena ilmaantuu spatiaalinen geelirakenne, joka sisältää soluissa entsyymimolekyylejä. Toisessa tapauksessa lääke lisätään valmiin polymeerin liuokseen. Se asetetaan sitten geelimäiseen tilaan.
Tukeutuminen läpikuultaviin rakenteisiin
Tämän immobilisointimenetelmän ydin on vesipitoisen entsyymiliuoksen erottaminen substraatista. Tätä varten käytetään puoliläpäisevää kalvoa. Se sallii kofaktorien ja substraattien pienimolekyylipainoisten elementtien kulkemisen ja säilyttää suuret entsyymimolekyylit.
Mikrokapselointi
On olemassa useita vaihtoehtoja upottamiseen läpikuultaviin rakenteisiin. Näistä mikrokapselointi ja proteiinien sisällyttäminen liposomeihin ovat eniten kiinnostavia. Ensimmäisen vaihtoehdon ehdotti vuonna 1964 T. Chang. Se koostuu siitä, että entsyymiliuos viedään suljettuun kapseliin, jonka seinämät on valmistettu puoliläpäisevästäpolymeeri. Kalvon ilmestyminen pinnalle johtuu yhdisteiden rajapintojen polykondensaatioreaktiosta. Yksi niistä liuotetaan orgaaniseen faasiin ja toinen - vesifaasiin. Esimerkkinä on sebasiinihappohalogenidin (orgaaninen faasi) ja heksametyleenidiamiini-1,6:n (vastaavasti vesifaasi) polykondensaatiolla saadun mikrokapselin muodostaminen. Kalvon paksuus lasketaan mikrometrin sadasosina. Kapseleiden koko on satoja tai kymmeniä mikrometrejä.
Liittyminen liposomeihin
Tämä immobilisointimenetelmä on lähellä mikrokapselointia. Liposomit ovat lamellaarisissa tai pallomaisissa lipidikaksoiskerrosjärjestelmissä. Tätä menetelmää käytettiin ensimmäisen kerran vuonna 1970. Liposomien eristämiseksi lipidiliuoksesta orgaaninen liuotin haihdutetaan. Jäljelle jäänyt ohut kalvo dispergoidaan vesiliuokseen, jossa entsyymi on läsnä. Tämän prosessin aikana tapahtuu lipidikaksoiskerrosrakenteiden itsensä kokoamista. Tällaiset immobilisoidut entsyymit ovat melko suosittuja lääketieteessä. Tämä johtuu siitä tosiasiasta, että suurin osa molekyyleistä on lokalisoitunut biologisten kalvojen lipidimatriisiin. Liposomeihin sisältyvät immobilisoidut entsyymit ovat lääketieteen tärkein tutkimusmateriaali, joka mahdollistaa elinprosessien kuvioiden tutkimisen ja kuvaamisen.
Uusien joukkovelkakirjalainojen muodostuminen
Immobilisointia muodostamalla uusia kovalenttisia ketjuja entsyymien ja kantajien välille pidetään yleisimpana menetelmänä teollisten biokatalyyttien saamiseksi.määränpäähän. Toisin kuin fysikaaliset menetelmät, tämä vaihtoehto tarjoaa peruuttamattoman ja vahvan sidoksen molekyylin ja materiaalin välille. Sen muodostumiseen liittyy usein lääkkeen stabiloituminen. Samanaikaisesti entsyymin sijainti 1. kovalenttisen sidoksen etäisyydellä kantajaan nähden aiheuttaa tiettyjä vaikeuksia katalyyttisen prosessin toteuttamisessa. Molekyyli erotetaan materiaalista insertin avulla. Sitä käytetään usein poly- ja bifunktionaalisina aineina. Erityisesti ne ovat hydratsiini, syaanibromidi, glutaaridialhedridi, sulfuryylikloridi jne. Esimerkiksi galaktosyylitransferaasin poistamiseksi seuraava sekvenssi lisätään kantajan ja entsyymin väliin -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. Tällaisessa tilanteessa rakenteessa on insertti, molekyyli ja kantaja. Kaikki ne on yhdistetty kovalenttisilla sidoksilla. Olennaista on tarve lisätä reaktioon funktionaalisia ryhmiä, jotka eivät ole välttämättömiä alkuaineen katalyyttisen toiminnan kann alta. Joten pääsääntöisesti glykoproteiinit kiinnittyvät kantajaan ei proteiinin, vaan hiilihydraattiosan kautta. Tuloksena saadaan vakaampia ja aktiivisempia immobilisoituja entsyymejä.
Solut
Edellä kuvattuja menetelmiä pidetään yleismaailmallisina kaikentyyppisille biokatalyyteille. Tällaisia ovat muun muassa solut, subsellulaariset rakenteet, joiden immobilisointi on viime aikoina yleistynyt. Tämä johtuu seuraavista. Kun solut on immobilisoitu, ei ole tarvetta eristää ja puhdistaa entsyymivalmisteita tai lisätä kofaktoreita reaktioihin. Tämän seurauksena on mahdollistajärjestelmät, jotka suorittavat monivaiheisia jatkuvia prosesseja.
Immobilisoitujen entsyymien käyttö
Eläinlääketieteessä, teollisuudessa ja muilla talouden aloilla yllä olevilla menetelmillä saadut lääkkeet ovat melko suosittuja. Käytännössä kehitetyt lähestymistavat tarjoavat ratkaisun ongelmiin kohdennetun lääkkeen kuljetuksen elimistöön. Immobilisoidut entsyymit mahdollistivat pitkäaikaisvaikutteisten lääkkeiden saamisen, joilla on minimaalinen allergeenisuus ja toksisuus. Tällä hetkellä tutkijat ratkaisevat massan ja energian biokonversioon liittyviä ongelmia mikrobiologisilla lähestymistavoilla. Samaan aikaan immobilisoitujen entsyymien teknologialla on myös merkittävä panos työhön. Kehitysnäkymät näyttävät olevan melko laajat. Joten jatkossa yksi avainrooleista ympäristön tilan seurannan prosessissa tulee olla uudentyyppisillä analyyseillä. Erityisesti puhumme bioluminesenssi- ja entsyymi-immunomääritysmenetelmistä. Edistyneet lähestymistavat ovat erityisen tärkeitä lignoselluloosaraaka-aineiden käsittelyssä. Immobilisoituja entsyymejä voidaan käyttää heikkoina signaalinvahvistimina. Aktiivinen keskus voi olla ultraäänen, mekaanisen rasituksen tai fytokemiallisten muutosten alaisena olevan kantajan vaikutuksen alaisena.
