Orgaanisen kemian aineita tutkittaessa käytetään yli tusinaa erilaista kvalitatiivista reaktiota tiettyjen yhdisteiden pitoisuuden määrittämiseen. Tällaisen visuaalisen analyysin avulla voit välittömästi ymmärtää, onko tarvittavia aineita läsnä, ja jos niitä ei ole, voit merkittävästi vähentää lisäkokeita niiden tunnistamiseksi. Näihin reaktioihin kuuluu ninhydriini, joka on tärkein aminoyhdisteiden visuaalisessa määrityksessä.
Mikä tämä on?
Ninhydriini on dikarbonyyliyhdiste, joka sisältää yhden aromaattisen renkaan, johon on kiinnittynyt heterosykli, jonka toisessa atomissa on 2 hydroksyyliryhmää (OH-). Tämä aine saadaan hapettamalla suoraan inandioni - 1, 3, ja siksi sillä on kansainvälisen nimikkeistön mukaan seuraava nimi: 2, 2 - dihydroksi-indioni -1, 3 (kuva 1).
Puhdas ninhydriini on keltainen tai valkoinen kidevärit, jotka kuumennettaessa liukenevat hyvin veteen ja muihin polaarisiin orgaanisiin liuottimiin, kuten asetoniin. Tämä on melko haitallinen aine, jos se joutuu kosketuksiin ihon tai limakalvojen kanssa suurina määrinä, se aiheuttaa ärsytystä, myös hengitettynä. Työskentely tämän yhdisteen kanssa tulee olla varovainen ja vain hansikkaita, koska joutuessaan kosketuksiin ihon kanssa se reagoi ihosolujen proteiinien kanssa ja värjää sen violetiksi.
Reaktiiviset aineet
Kuten edellä mainittiin, ninhydriinireaktiota käytetään ensisijaisesti aminoyhdisteiden pitoisuuden visuaaliseen määrittämiseen:
- α-aminohapot (myös proteiineissa);
- aminosokerit;
- alkaloidit, jotka sisältävät –NH2 ja -NH-ryhmiä;
- eri amiinit.
On huomattava, että sekundaariset ja tertiääriset amiinit reagoivat joskus hyvin heikosti, joten tarvitaan lisää tutkimusta niiden läsnäolon vahvistamiseksi.
Kvantitatiiviseen määritykseen käytetään erilaisia kromatografiamenetelmiä, esimerkiksi paperikromatografiaa (BC), ohutkerroskromatografiaa (TLC) tai kiinteiden kantajien pesua ninhydriiniliuoksella erilaisissa väliaineissa.
Tämä reaktio ei ole spesifinen aminoyhdisteille, koska reagenssi voi mennä siihen kaikkien kanssa kerralla. Reaktiotuotteiden puolelta sillä on kuitenkin erityispiirre hiilidioksidikuplien vapautumisen muodossa (CO2), ja tämä on tyypillistä vain vuorovaikutuksessa α-aminon kanssa. hapot.
Mekanismin ominaisuudet
BKirjallisuudessa on erilaisia tulkintoja ninhydriinireaktioyhtälöstä. Jotkut tutkijat jättävät pois hydrindantiinin muodostumisen 2-amino-indionista, joka ammoniakin ja ninhydriinin kanssa muodostaa myös väriaineen nimeltä "Ruemanin purppura" (tai "Ruemanin sininen"), kun taas toiset päinvastoin olettavat vain sen osallistuminen ilman välituoteaminotuotteiden läsnäoloa. Myös itse reaktiosta löytyy mielenkiintoisia kohtia, erityisesti tämä koskee menetelmiä, joilla ninhydriinin aminojohdannainen kiinnitetään päämolekyyliinsä väriaineen muodostamiseksi. Myös amiinin vesipitoisesta väliaineesta saaman "kävelevän vedyn" paikan osoittaminen jää kyseenalaiseksi: se voi olla joko ketoniryhmässä tai vieressä –NH2.
Todellisuudessa vivahde H-atomin kanssa on merkityksetön, koska sen asemalla yhdisteessä ei ole erityistä roolia reaktion kulussa, joten siihen ei pidä kiinnittää huomiota. Mitä tulee yhden mahdollisen vaiheen pois jättämiseen, syy tässä piilee teoreettisessa näkökulmassa: toistaiseksi tarkkaa mekanismia Ruemanin purppuran muodostumiselle ei ole tarkasti määritelty, joten ninhydriinireaktion kaavioita voidaan löytää melko erilaisia.
Alla ehdotetaan täydellisintä mahdollista reagenssin vuorovaikutusta aminoyhdisteiden kanssa.
Reaktiomekanismi
Ensinnäkin ninhydriini on vuorovaikutuksessa α-aminohapon kanssa kiinnittäen sen hydroksiryhmien pilkkoutumiskohtaan ja muodostaen kondensaatiotuotteen (kuva 2a). Sitten jälkimmäinen tuhoutuu, jolloin vapautuu välituoteamiinia, aldehydiä ja hiilidioksidia (kuva 2b). Lopputuotteesta liittyessäänninhydriini, Ruemanin purppurarakenne (diketonhydrindenketohydriiniamiini, kuva 2c) syntetisoidaan. On myös osoitettu hydrindantiinin (pelkistetty ninhydriini) mahdollinen muodostuminen välituoteamiinista, joka myös muuttuu väriaineyhdisteeksi ammoniakin (tarkemmin ammoniumhydroksidin) läsnä ollessa itse reagenssiylimäärän kanssa (kuva 2d).
Rueman itse todisti hydrindantiinin muodostumisen, kun rikkivety vaikuttaa ninhydriinimolekyyliin. Tämä yhdiste pystyy liukenemaan natriumkarbonaattiin Na2CO3, mikä värjää liuoksen tummanpunaiseksi. Ja kun laimeaa suolahappoa lisätään, hydrindantiini saostuu.
Todennäköisimmin välituoteamiini, hydridantiini, ninhydriini ja väriaineen rakenne ovat kuumennettaessa epästabiiliudesta johtuen jossain tasapainossa, mikä mahdollistaa useiden lisävaiheiden läsnäolon.
Tämä mekanismi sopii ninhydriinireaktion selittämiseen muiden aminoyhdisteiden kanssa, lukuun ottamatta sivutuotteita, jotka syntyvät rakenteen muun osan eliminoinnista -NH2, -NH tai -N.
Biureetti ja muut reaktiot proteiineihin
Peptidisidosten laadullinen analyysi jopa ei-proteiinirakenteille voi tapahtua paitsi edellä mainitun reagenssin kanssa. Ninhydriinireaktiossa proteiineihin vuorovaikutus ei kuitenkaan tapahdu -CO-NH‒-ryhmiä pitkin, vaan amiiniryhmiä pitkin. On olemassa niin kutsuttu "biureettireaktio", jolle on ominaista ionien lisääminen liuokseen aminoyhdisteiden kanssabivalenssista kuparia CuSO4 tai Cu(OH)2 alkalisessa väliaineessa (kuva 3).
Analyysin aikana liuos muuttuu tarvittavien rakenteiden läsnä ollessa tummansiniseksi johtuen peptidisidosten sitoutumisesta värikompleksiksi, joka erottaa reagenssin toisesta. Tästä syystä biureetin ja ninhydriinin reaktiot ovat universaaleja suhteessa proteiini- ja ei-proteiinirakenteisiin, joissa on ryhmä –CO-NH‒.
Syklisiä aminohappoja määritettäessä käytetään ksantoproteiinireaktiota väkevän typpihappoliuoksen kanssa HNO3 , joka antaa keltaisen värin nitrattuna. Iholla oleva pisara reagenssia saa myös keltaisen värin reagoimalla ihosolujen aminohappojen kanssa. Typpihappo voi aiheuttaa palovammoja, ja sitä tulee myös käsitellä käsineillä.
Esimerkkejä vuorovaikutuksesta aminoyhdisteiden kanssa
Ninhydriinireaktio α-aminohapoille antaa hyvän visuaalisen tuloksen lukuun ottamatta väriproliini- ja hydroksiproliinirakenteita, jotka reagoivat muodostaen keltaista väriä. Mahdollinen selitys tälle vaikutukselle löydettiin muista ympäristöolosuhteista ninhydriinin vuorovaikutukselle näiden rakenteiden kanssa.
Reaktio aminoryhmän kanssa
Koska testi ei ole spesifinen, alaniinin visuaalinen havaitseminen käyttämällä seoksen ninhydriinireaktiota ei ole mahdollista. Paperikromatografialla voidaan kuitenkin levittää näytteitä erilaisista α-aminohapoista, suihkuttaa niitä ninhydriinin vesiliuoksella ja kehittää erityisessä väliaineessa.laskea vaaditun yhdisteen, mutta myös monien muiden yhdisteiden määrällinen koostumus.
Kaavamaisesti alaniinin vuorovaikutus ninhydriinin kanssa noudattaa samaa periaatetta. Se kiinnittyy reagenssiin amiiniryhmästä, ja aktiivisten hydronium-ionien (H3O+) vaikutuksesta irtoaa hiilestä. -typpisidos, joka hajoaa asetaldehydiksi (CH3COH) ja hiilidioksidiksi (CO2). Toinen ninhydriinimolekyyli kiinnittyy typpeen syrjäyttäen vesimolekyylejä ja muodostuu värillinen rakenne (kuva 4).
Reaktio heterosyklisen aminoyhdisteen kanssa
Ninhydriinin reaktio proliinin kanssa on spesifinen, erityisesti kromatografisissa analyyseissä, koska tällaiset rakenteet happamassa väliaineessa muuttuvat ensin keltaisiksi ja sitten purppuraisiksi neutraalissa. Tutkijat selittävät tämän väliyhdisteen syklin uudelleenjärjestelyn ominaisuudella, johon vaikuttaa nimenomaan suuri määrä vetyprotoneja, jotka täydentävät typen ulkoista energiatasoa.
Heterosyklin tuhoutuminen ei tapahdu, ja siihen kiinnittyy toinen ninhydriinimolekyyli 4. hiiliatomiin. Edelleen kuumennettaessa tuloksena oleva rakenne neutraalissa väliaineessa muuttuu Rueman-violetiksi (kuva 5).
Pääreagenssin valmistus
Ninhydriinitesti suoritetaan eri liuoksilla riippuen aminorakenteiden liukenemisesta tiettyihin orgaanisiin jaepäorgaaniset yhdisteet.
Pääreagenssi on 0,2-prosenttisen vesiliuoksen valmistaminen. Tämä on monipuolinen seos, koska useimmat yhdisteet liukenevat hyvin H2O:hon. Juuri valmistetun reagenssin saamiseksi laimennetaan 0,2 g:n näyte kemiallisesti puhdasta ninhydriiniä 100 ml:aan vettä.
On syytä huomata, että joillekin analysoiduille liuoksille tämä pitoisuus on riittämätön, joten voidaan valmistaa 1 % tai 2 % liuoksia. Tämä on tyypillistä lääkeraaka-aineuutteille, koska ne sisältävät erilaisia aminoyhdisteluokkia.
Kromatografisia tutkimuksia suoritettaessa liuoksia, esimerkiksi pestäessä seosta kiinteällä kantajalla pylvään läpi, voidaan valmistaa alkoholiin, dimetyylisulfoksidiin, asetoniin ja muihin polaarisiin liuottimiin - kaikki riippuu tiettyjen liuottimien liuottimesta. aminorakenteet.
Hakemus
Ninhydriinireaktio mahdollistaa useiden aminoyhdisteiden havaitsemisen liuoksessa, mikä teki siitä yhden ensimmäisistä, joita käytettiin orgaanisten aineiden kvalitatiivisessa analyysissä. Visuaalinen määritys vähentää merkittävästi kokeiden määrää, varsinkin kun analysoidaan huonosti tutkittuja kasveja, lääkkeitä ja annosmuotoja sekä tuntemattomia liuoksia ja seoksia.
Oikeuslääketieteessä tätä menetelmää käytetään laaj alti hikijälkien määrittämiseen kaikilla pinnoilla.
Reaktion epäspesifisyydestä huolimatta ninhydriinireaktion poistaminen kemiallisesta käytännössä on mahdotonta, koskatämän aineen korvaaminen vähemmän myrkyllisillä analogeilla (esimerkiksi oksoliinilla) osoitti, että niillä on huonompi herkkyys aminoryhmille eivätkä ne anna hyviä tuloksia fotometrisissä analyyseissä.
