Epäorgaanisten ja orgaanisten väliaineiden aiheuttama valon absorptio ja edelleen uudelleenemissio on seurausta fosforesenssista tai fluoresenssista. Ilmiöiden välinen ero on valon absorption ja virran emission välisen aikavälin pituus. Fluoresenssin kanssa nämä prosessit tapahtuvat lähes samanaikaisesti ja fosforesenssissa jonkin verran viiveellä.
Historiallista taustaa
Vuonna 1852 brittiläinen tiedemies Stokes kuvasi ensimmäisen kerran fluoresenssia. Hän loi uuden termin fluorisälvän kokeiden tuloksena, joka säteili punaista valoa altistuessaan ultraviolettivalolle. Stokes havaitsi mielenkiintoisen ilmiön. Hän havaitsi, että fluoresoivan valon aallonpituus on aina pidempi kuin viritysvalon.
1800-luvulla tehtiin monia kokeita hypoteesin vahvistamiseksi. He osoittivat, että monet näytteet fluoresoivat ultraviolettivalolle altistuessaan. Materiaalit sisälsivät mm. kiteitä, hartseja, mineraaleja, klorofylliä,lääkeraaka-aineet, epäorgaaniset yhdisteet, vitamiinit, öljyt. Väriaineiden suora käyttö biologiseen analyysiin alkoi vasta vuonna 1930
Fluoresenssimikroskopian kuvaus
Jotkin 1900-luvun alkupuoliskolla tutkimuksessa käytetyistä materiaaleista olivat erittäin spesifisiä. Varjoainemenetelmillä saavuttamattomien indikaattoreiden ansiosta fluoresenssimikroskopiamenetelmästä on tullut tärkeä työkalu sekä biolääketieteellisessä että biologisessa tutkimuksessa. Saaduilla tuloksilla ei ollut vähäistä merkitystä materiaalitieteen kann alta.
Mitä hyötyä fluoresenssimikroskoopista on? Uusien materiaalien avulla tuli mahdolliseksi eristää erittäin spesifisiä soluja ja submikroskooppisia komponentteja. Fluoresoivan mikroskoopin avulla voit havaita yksittäisiä molekyylejä. Erilaisten väriaineiden avulla voit tunnistaa useita elementtejä samanaikaisesti. Vaikka laitteiston avaruudellista erottelukykyä rajoittaa diffraktioraja, joka puolestaan riippuu näytteen erityisominaisuuksista, on myös tämän tason alapuolella olevien molekyylien havaitseminen täysin mahdollista. Useat näytteet osoittavat autofluoresenssia säteilytyksen jälkeen. Tätä ilmiötä käytetään laaj alti petrologiassa, kasvitieteessä ja puolijohdeteollisuudessa.
Ominaisuudet
Eläinkudosten tai patogeenisten mikro-organismien tutkimusta vaikeuttaa usein joko liian heikko tai erittäin voimakas epäspesifinen autofluoresenssi. Kuitenkin arvo sisäänTutkimus hankkii materiaaliin komponenttien, jotka virittyvät tietyllä aallonpituudella ja lähettävät vaaditun intensiteetin valovirtaa. Fluorokromit toimivat väriaineina, jotka pystyvät kiinnittymään rakenteisiin (näkyviin tai näkymättömiin). Samaan aikaan niille on ominaista korkea selektiivisyys kohteiden ja kvanttituoton suhteen.
Fluoresenssimikroskopiasta on tullut laaj alti käytetty luonnollisten ja synteettisten väriaineiden myötä. Niillä oli erityiset emissio- ja viritysintensiteettiprofiilit, ja ne oli suunnattu tiettyihin biologisiin kohteisiin.
Yksittäisten molekyylien tunnistaminen
Usein ihanteellisissa olosuhteissa voit rekisteröidä yksittäisen elementin hehkun. Tätä varten on muun muassa varmistettava riittävän alhainen ilmaisinkohina ja optinen tausta. Fluoreseiinimolekyyli voi lähettää jopa 300 000 fotonia ennen kuin se tuhoutuu valovalkaisun vuoksi. 20 % keräysasteella ja prosessitehokkuudella niitä voidaan rekisteröidä noin 60 tuhatta
Fluoresenssimikroskopia, joka perustuu lumivyöryvalodiodeihin tai elektronien lisääntymiseen, antoi tutkijoille mahdollisuuden tarkkailla yksittäisten molekyylien käyttäytymistä sekuntien ja joissakin tapauksissa minuuttien ajan.
Vaikeudet
Avainongelma on optisen taustan kohinanvaimennus. Koska monissa suodattimien ja linssien valmistuksessa käytetyissä materiaaleissa on jonkin verran autofluoresenssia, tutkijoiden ponnistelut keskittyivät alkuvaiheessakomponentit, joilla on alhainen fluoresenssi. Myöhemmät kokeet johtivat kuitenkin uusiin johtopäätöksiin. Erityisesti sisäiseen kokonaisheijastukseen perustuvan fluoresenssimikroskopian on todettu saavuttavan matalan taustan ja suuren viritysvalotehon.
Mekanismi
Fluoresenssimikroskoopin periaatteet, jotka perustuvat sisäiseen kokonaisheijastukseen, ovat nopeasti vaimenevan tai leviämättömän aallon käyttö. Se syntyy eri taitekertoimien omaavien välineiden rajapinnassa. Tässä tapauksessa valonsäde kulkee prisman läpi. Sillä on korkea taitekerroin.
Prisma on vesiliuoksen tai matalaparametrisen lasin vieressä. Jos valonsäde suunnataan siihen kulmassa, joka on suurempi kuin kriittinen, säde heijastuu kokonaan rajapinnasta. Tämä ilmiö puolestaan aiheuttaa ei-etenevän aallon. Toisin sanoen syntyy sähkömagneettinen kenttä, joka läpäisee väliaineen, jonka taitekerroin on pienempi kuin 200 nanometrin etäisyydellä.
Ei-etenevässä aallossa valon intensiteetti on aivan riittävä herättämään fluoroforit. Poikkeuksellisen matalan syvyyden vuoksi sen tilavuus on kuitenkin hyvin pieni. Tuloksena on matalan tason tausta.
Muutos
Fluoresenssimikroskopia, joka perustuu sisäiseen kokonaisheijastukseen, voidaan toteuttaa epi-valaistuksella. Tämä vaatii linssejä, joissa on suurempi numeerinen aukko (vähintään 1,4, mutta on toivottavaa, että se saavuttaa 1,45-1,6), sekä laitteen osittain valaistu kenttä. Jälkimmäinen saavutetaan pienellä paikalla. Tasaisuuden lisäämiseksi käytetään ohutta rengasta, jonka läpi osa virtauksesta estetään. Jotta saadaan kriittistä kulmaa, jonka jälkeen tapahtuu täydellinen heijastus, linsseissä ja mikroskoopin suojalasissa olevan upotusaineen taittumisen on oltava korkea.
