Bakteereiden viljely: menetelmät, periaatteet, vaiheet ja olosuhteet

2024 Kirjoittaja: Angel Austin | [email protected]. Viimeksi muokattu: 2023-12-17 05:25

Mikro-organismeja ympärillämme olevassa luonnossa on kaikkialla: maaperässä, vesistöissä, erilaisten esineiden pinnoilla, niiden asuttamia ihmisiä ja eläimiä. Kaikki tämä voi toimia elintarvikkeiden, lääkkeiden ja tuotantolinjojen mikrobikontaminaation lähteenä. Bakteerien viljely on välttämätöntä niiden ominaisuuksien, tarpeiden ja ominaisuuksien tutkimiseksi. Tämä puolestaan on tärkeä askel erilaisten lääkkeiden kehittämisessä, sairauksien laboratoriodiagnoosissa, tuotantoreaktorien laskennassa ja paljon muuta.

Yleiset käsitteet

Bakteereiden viljelyllä mikrobiologiassa tarkoitetaan mikro-organismien viljelyä laboratoriossa. Viljelmäksi kutsutaan vuorostaan mikrobeja, jotka ovat kasvaneet valitulla ravintoalustalla. Viljelmiä voidaan sekoittaa, jos ne muodostuvat erityyppisistä mikro-organismeista, ja puhtaita, jos niitä edustaa vain yksi bakteerityyppi.

Jos ravitsemuksellistaElatusaineeseen sijoitetaan vain yksi solu ja sen lisääntymisen seurauksena saadaan ryhmä yksilöitä, jolloin tätä mikro-organismien joukkoa kutsutaan klooniksi. Kun klooni kehittyy pisteeseen, jossa se näkyy paljaalla silmällä, tätä bakteerikokoelmaa kutsutaan pesäkkeeksi.

Yleensä eri lähteistä eristettyjen bakteerien viljely suoritetaan erillään toisistaan. Jokaista tällaista erikseen kasvatettua mikrobiryhmää kutsutaan kannaksi. Joten jos yksi stafylokokkityyppi eristetään kolmesta lähteestä (tai saman tuotteen eri osista, eri ihmisistä), he puhuvat kolmesta tämäntyyppisen stafylokokin kannasta.

Bakteerien kasvutekijät

Näitä ovat erilaiset aminohapot, lipidit, puriiniemäkset ja muut mikro-organismien kehittymiselle välttämättömät yhdisteet. Jotkut mikrobit voivat tuottaa itsenäisesti tarvitsemiaan aineita, kun taas toisten on saatava ne valmiina. Tietyissä kasvutekijöissä olevien mikro-organismien tarpeiden mukaan suoritetaan bakteerien tunnistaminen ja erottaminen. Tämä parametri on myös tärkeä laboratorio- ja bioteknologiseen työhön tarkoitetun ravintoalustan oikean valmistuksen kann alta:

• Aminohapot. Bakteerit voivat vaatia yhden tietyn aminohapon tai happoryhmän. Joten klostridit tarvitsevat leusiinia ja tyrosiinia, streptokokit tarvitsevat leusiinia ja arginiinia. Mikro-organismeja, jotka tarvitsevat aminohappoja ulkopuolelta kasvaakseen, kutsutaan auksotrofeiksi.
• Puriini- ja pyrimidiiniemäkset sekä niiden johdannaiset (adeniini, guaniini ja muut). Ne ovat tärkeä tekijä monien kasvussaStreptococcus-lajit.
• Vitamiinit. Ne ovat osa bakteerien tarvitsemia koentsyymejä. Joten nikotiinihappoa ja sen amidia, jotka ovat osa NAD:ta ja NADP:tä, tarvitsevat kurkkumätä ja shigella corynebakteerit. Tiamiinia, kiinteänä osana pyrofosfaattia, tarvitsevat Staphylococcus aureus, pneumokokki, brucella. Pantoteenihappoa, joka on osa CoA-koentsyymiä, tarvitsevat tetanusbasillit ja tietyt streptokokkityypit. Sytokromit ja siten niitä muodostavat foolihappo, heemit ja biotiini ovat välttämättömiä Mycobacterium tuberculosis- ja Haemophilus influenzae -bakteerille.

Ympäristövaatimukset

Edellytykset viljelyalustoille bakteerien viljelyyn:

1. Ravinto. Niiden tulee lisäksi sisältää helposti sulavassa muodossa aineita, joita mikro-organismit tarvitsevat ruokkimaan ja täydentämään energiaa. Näitä ovat organogeenit ja mineraalit. Jotkut mikro-organismit tarvitsevat lisäksi vitamiineja ja aminohappoja, joita ne eivät voi syntetisoida.
2. Optimaalinen pH-taso. Se vaikuttaa solukalvon läpäisevyyteen ja vastaavasti bakteerin kykyyn imeä ravinteita. Useimmiten pH-arvon tulee olla tasolla 7, 2–7, 4. Monet mikro-organismit tuottavat elämänsä aikana tuotteita, joissa on happamia tai emäksisiä reaktioita, ja jotta ravintoalustan pH ei muutu, se on puskuroitava.
3. Isotoninen. Bakteerien viljelyyn tarkoitetun ravintoaineen osmoottisen paineen tulisi olla samat kuinmikrobisolujen sisällä. Se vastaa yleensä 0,5 % NaCl-liuosta.
4. Steriiliys. Tämä johtuu siitä, että vieraiden bakteerien ilmaantuminen vääristää analysoidun kannan tutkimuksen tuloksia.
5. Kosteustaso. Tällä indikaattorilla ja alustan koostumuksella tulisi olla optimaaliset ominaisuudet tietylle bakteerityypille.
6. Redox-potentiaali (RH2). Se näyttää elektroneja luovuttavien ja vastaanottavien aineiden suhteen sekä ravinneväliaineen happisaturaatiotason. Aerobeilla ja anaerobeilla bakteerien viljelyolosuhteet vaihtelevat jonkin verran tässä indikaattorissa. Anaerobiset mikro-organismit lisääntyvät parhaiten RH2-arvoilla alle 5 ja aerobiset mikro-organismit vähintään 10.
7. Yhdenmukaisuus. On tärkeää, että elatusaine sisältää vakiomäärät sen yksittäisiä aineosia. Lisäksi suositaan kirkkaita ratkaisuja, jotka helpottavat sadon kasvun seurantaa tai saastumisen havaitsemista.

Elatusainetyypit

Mikro-organismien kasvualustan valintaan vaikuttavat monet tekijät, joita ovat muun muassa niiden ravinnon ominaisuudet ja tutkimuksen tarkoitus. Tärkeimmät ravinnealustojen luokittelun taustalla olevat piirteet ovat:

1. Komponentit. Alustan luomiseen käytettyjen alkuperäisten aineiden mukaan ne erottavat:

• luonnollisia, jotka on valmistettu eläin- tai kasviperäisistä tuotteista (esim. liha, maito, hedelmät) ja soveltuvat kasvatukseen sekoitettunasato;
• puolisynteettinen, jossa kalliit luonnolliset elintarviketuotteet korvataan ei-elintarvikkeilla (esim. luujauho, veritulpat) ja jotka ovat optimaalisia tietyntyyppisten bakteerien viljelyyn tai niiden aineenvaihduntatuotteiden eristämiseen ympäristö;
• synteettiset, jotka valmistetaan tarkoista määristä kemiallisia yhdisteitä, joiden koostumus tunnetaan vakiona ja ne ovat helposti toistettavissa.

2. Konsistenssi (tiheys). Erottele ympäristöt:

• neste;
• tiheä;
• puolineste.

Kaksi viimeistä valmistetaan erikoisliuoksista tai nestemäisistä aineista lisäämällä agar-agaria tai gelatiinia vaaditun tiheyden aikaansaamiseksi. Lisäksi tiheä ympäristö bakteerien kasvulle on hyytynyt veriseerumi, perunat, silikageeliväliaine, karrageeni.

3. Yhdiste. Tällä perusteella ympäristöt ovat:

• yksinkertainen, jonka luettelo on lyhyt: Lihapeptoniliemi (MBB), Hottingerin liemi ja agar, lihapeptoniagar (MPA), ravintogelatiini ja peptonivesi.
• kompleksi, valmistettu yksinkertaisista lisäämällä verta, heraa, hiilihydraatteja ja muita aineita.

4. Nimittäminen. Seuraavat ravintoalustat erotetaan toisistaan:

• päätä käytetään monien patogeenisten mikrobien kasvattamiseen (yleensä yksinkertainen koostumus);
• erityisiä käytetään sellaisten bakteerien eristämiseen ja viljelemiseen, jotka eivät kasva yksinkertaisilla substraateilla;
• selektiiviset (ne ovat myös selektiivisiä) sopivat tietyntyyppisten bakteerien eristämiseen ja estävät niihin liittyvien mikrobien kasvua (selektiivisyysluotu lisäämällä väliaineeseen tiettyjä aineita, kuten antibiootteja tai suoloja, tai säätämällä pH:ta);
• differentiaalidiagnostiikka mahdollistaa bakteerityypin erottamisen toisista arvioimalla esimerkiksi alustan entsymaattista aktiivisuutta;
• säilöntäaineita tarvitaan ensimmäiseen inokulaatioon ja myöhempään näytteiden kuljetukseen, koska ne estävät mikro-organismien kuoleman sekä estävät muiden bakteerien kasvua.

Media valmistelu

Tärkein vaihe anaerobisten bakteerien viljelyssä on sopivan ravintoalustan valmistaminen. Kun optimaaliset parametrit on valittu, siirry seuraaviin vaiheisiin:

• punnitus, valitsemalla näyte komponenteista analyyttisestä vaa'sta;
• liuotus suoritetaan tislattuun veteen, joka on lämmitetty 70 °C:seen, ja fosfaatit, mikro- ja makrosuolat liuotetaan erikseen;
• keittää vesihauteessa kaksi minuuttia;
• pH:n määritys indikaattoripaperilla tai potentiometrillä;
• suodatus märän kangas- tai paperisuodattimien läpi nestemäisille ja sulaille tiheille väliaineille ja puuvillaharsosuodattimen läpi agar-väliaineille;
• pullotus suoritettu 3/4 kapasiteetilla;
• keskiriippuvainen sterilointi;
• steriiliyden valvonta suoritetaan asettumalla kahdeksi päiväksi termostaattiin, jonka jälkeen katsotaan;
• kemiallinen valvonta pH:n ja tarvittavan sisällön määrittämiseksituotteet;
• biologinen torjunta koerokotuksella.

Lasien ja materiaalien sterilointi

Yksi bakteeriviljelyn perusperiaatteista on steriiliys. Vieraiden mikro-organismien kasvu ja kehitys voivat vaikuttaa ravintoalustan ominaisuuksiin muuttamalla sen kemiallista koostumusta ja pH:ta. Sterilointi on tärkein edellytys puhdasviljelmien kasvattamiselle. Käytännössä tämä termi tarkoittaa menetelmiä täysin kaikkien elämänmuotojen tuhoamiseksi steriloitujen esineiden pinnalla ja tilavuudessa. Tutkimuksen aikana käytetyt astiat, instrumentit, väliaineet ja muut esineet steriloidaan.

Jotkin sterilointityypit:

• Sytytys. Silmukoiden ja neulojen sterilointi kylvöä varten, lasilevyt, jotkut instrumentit voidaan suorittaa polttimella tai alkoholilampulla.
• Kiehuu. Soveltuu ruiskujen, neulojen, ruoan käsittelyyn, mutta ei tapa bakteeri-itiöitä.
• Kuivasterilointi. Se suoritetaan erityisessä kuivauskaapissa ja sopii pullojen, koeputkien ja muiden laboratoriolasiesineiden käsittelyyn.
• Höyrysterilointi. Autoklaavissa suoritettuna tämä menetelmä on erittäin tehokas. Mutta se ei sovellu ravintoalustoille, jotka sisältävät proteiineja tai muita korkeassa lämpötilassa hajoavia yhdisteitä. Säästävämpää voidaan kutsua tyndalisaatioksi. Se suoritetaan Koch Boilerissa ja yhdistää itiöiden itämisen niiden tuhoamiseen.
• Pastörointi. Sitä käytetään väliaineille, jotka muuttavat ominaisuuksiaan keitettäessä (esim. maito, viini, olut), jotka kykenevätpoistaa ne itiöttömästä mikro-organismista. Käsittelylämpötila on vain 50-60 °C 15-30 minuutin ajan. Joissakin tapauksissa käytetään kylmästerilointia, joka suoritetaan suodattimilla tai UV-säteillä.

Bakteerien viljelyolosuhteet

Bakteereiden kasvu ja kehitys on mahdollista vain tietyillä tekijöillä ja niiden arvoilla:

1. Lämpötila. On olemassa kolme bakteeriryhmää, jotka eroavat lämpötilamieltymyksistä:

• termofiilit eli lämpöä rakastavat mikrobit kasvavat 45-90°C:ssa, mikä tarkoittaa, että ne eivät lisäänty ihmis- ja eläinorganismeissa;
• psykrofiilit eli kylmää rakastavat mikro-organismit pitävät 5-15 °C:n lämpötiloista ja niitä kasvatetaan kylmävarastoissa;
• mesofiilit kehittyvät 25-37 °C:n lämpötilassa, ne sisältävät suurimman osan bakteereista.

2. Kevyt. Se on ominaisuus fototrofisten bakteerien viljelyssä, koska ne suorittavat fotosynteesiprosessin. Mutta useimmille mikrobeille valaistus ei ole edellytys. Ja jopa päinvastoin, auringon ultraviolettisäteily voi estää niiden kehittymisen.

3. Vesi. Kaikki mikro-organismit tarvitsevat vettä saatavilla olevassa (nestemäisessä) muodossa. Siksi pakasteruoassa ei juurikaan kasva lainkaan bakteereja.

4. Ympäristön happamuus. Tätä bakteerien viljelyn periaatetta on jo käsitelty yksityiskohtaisesti edellä.

5. Ilmastus. Happi kemiallisena alkuaineena on olennainen osa vettä ja huomattava määrä yhdisteitä, joita käytetäänmikro-organismien viljely. Kaasumaista happea voi sisältää myös vesi ja muut nesteet liuenneena. Merkittävä osa bakteereista tarvitsee jatkuvaa happimolekyylejä. Mutta useille mikro-organismeille se on tarpeetonta, tai mikä pahempaa, kaasumainen happi on niille myrkyllistä, koska niillä ei ole katalaasia ja peroksidaasia, jotka tuhoavat myrkyllisiä hengityselimiä. Siksi tärkein vaihe anaerobisten bakteerien viljelyssä on O₂ molekyylien poistaminen ravintoalustasta.

6. Mikro-organismien viljely. Aerobisten ja anaerobisten bakteerien viljely tapahtuu ympäristön eri kerroksissa ja eri tavoissa.

Aerobisten mikro-organismien viljely

Aerobisten bakteerien viljely vaatii molekulaarista happea. Puhtaiden aerobiviljelmien saamiseksi, joita voidaan menestyksekkäästi käyttää lääketieteessä ja elintarviketeollisuudessa, käytetään seuraavia menetelmiä:

• pinta kasvaa tiheällä alustalla tai nestemäisellä alustalla (niiden ohut kerros), kun happea tulee suoraan ilmasta;
• syväviljely nestemäisissä väliaineissa, kun niihin liuenneen hapen määrän lisääminen saavutetaan jatkuvalla ilmastuksella.

Anaerobisten mikro-organismien viljely

Tällaisten bakteerien viljelyn perusperiaate on niiden minimaalinen kosketus ilmakehän hapen kanssa. Niiden kasvun edellytysten luominen on paljon vaikeampaa kuin aerobeille. Seuraavia menetelmiä käytetään anaeroobien eristämiseen molekyylistä O₂:

1. Fyysinen. Tämä anaerobisten bakteerien viljelymenetelmä rajoittuu niiden viljelyyn erityisessä tyhjiölaitteessa - mikroanaerostaatissa. Sen ilma korvataan erityisellä typen kaasuseoksella, johon on lisätty 10 % vetyä ja 5 % hiilidioksidia.
2. Kemia. Näitä ovat: absorboivien aineiden käyttö (esim. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) tai pelkistäviä aineita (kuten askorbiinihappoa).
3. Biologinen. Se johtuu aerobien ja anaeroobien yhteisviljelystä suljetussa järjestelmässä. Tämä menetelmä bakteerien viljelyyn käsittää sen, että puolet petrimaljasta kylvetään joillakin aerobisilla bakteereilla ja toiselle puolelle tutkitulla anaerobilla. Sen kehitys alkaa sillä hetkellä, kun kaikki happi on käytetty.

Seuraavat kylvömenetelmät sopivat anaerobisten bakteerien viljelyyn:

• pintakerroksessa;
• steriilillä parafiinilla täytetyssä pintakerroksessa;
• tiheän ravintoalustan paksussa;
• syvissä kerroksissa viskoosia materiaalia.

Puhdaskulttuurin saaminen

Mikrobiologit työskentelevät yleensä näytteiden kanssa, joissa on monia erilaisia mikrobeja. Mikro-organismien (perhe, suku, lajit) systemaattisen sijainnin määrittämiseksi sekä niiden ominaisuuksien tutkimiseksi on kuitenkin tarpeen eristää ne ja kasvattaa puhdasta viljelmää. Niillä on suuri merkitys monilla elintarviketeollisuuden aloilla, esimerkiksi juusto, leipä, kvass, viini jne. Maitohappobakteerien viljely mahdollistaaolennainen komponentti fermentoitujen maitotuotteiden, taikinan, kaakaon, säilörehun ja jopa muovin tuotannossa.

Menetelmä puhtaan viljelmän eristämiseksi tiheässä alustassa perustuu mikro-organismisolujen mekaaniseen erottamiseen ja niiden myöhempään eristettyyn viljelyyn. Näyte siirretään steriiliin tilavuuteen vettä tai suolaliuosta (tilavuus 10-100 ml) ja ravistellaan sitten kaksi minuuttia. Tutkittavan materiaalin (esimerkiksi makkaroiden tai juuston) paksuudessa olevien mikro-organismien erottamiseksi suoritetaan ensin näytekappaleiden hankaus steriileillä instrumenteilla hiekalla. Esivalmistettu materiaali, joka painaa 1 g tai tilavuus 1 ml, laimennetaan steriilillä vedellä 10, 100, 1000 jne. kertaa. Laimennusaste valitaan siten, että saadaan menetelmän kykyjä vastaava solukonsentraatio.

Mikro-organismien myöhempi viljely on ravintoalustan valmistamista. Yleensä valitaan tiheä väliaine (MPA). Ensin se sulatetaan ja jäähdytetään 45-50 °C:seen, ja vasta sitten se kaadetaan useisiin petrimaljoihin (kolmesta viiteen kappaletta), joiden pohjalle laitetaan eri pitoisuuksilla olevia vanupuikkoja testiaineesta. Seuraavaksi suoritetaan vielä jäätyneen ravintoalustan ja siihen lisätyn materiaalin sekoitus. Näin solut kiinnitetään eri kohtiin substraatin tilavuudessa.

Seuraavaksi petrimaljat asetetaan termostaattiin 2 päiväksi 22 °C:seen. Tänä aikana solut lisääntyvät siinä määrin, että kunkin solun muodostama pesäke tulee näkyviin paljaalla silmällä. Jokainen niistä on puhdas viljelmä bakteerityypistä, jonka soluista se on peräisinruusu.

Sen jälkeen petrimaljoilta mikro-organismit aliviljellään erillisiin koeputkiin, jotka on täytetty ravintoaineella. Tällä tavalla puhdasviljelmät eristetään sekanäytteestä. Tämä menetelmä kantaa kehittäjän nimeä - R. Koch. Sitä kutsutaan yleisesti myös kuppimenetelmäksi tai tyhjentäväksi kylvöksi. Kun erityyppisistä bakteereista on saatu puhdasviljelmät, niiden muoto, itiöt ja perheet määritetään.

Kaikki työt on suoritettava aseptiikan periaatteiden mukaisesti. Mikro-organismien ennenaikaisen kehittymisen välttämiseksi tutkimus on suoritettava välittömästi näytteenoton jälkeen. Vesijohtovesi analysoidaan ensimmäisten annosten tyhjennyksen jälkeen, koska ne voivat sisältää putkiin ja hanoihin kerääntyneitä mikrobeja. Hedelmien, marjojen ja vihannesten mikrofloora sijaitsee pääosin pinnalla (kuorella), joten pesut suoritetaan siitä. Tätä varten aseta sikiö steriiliin astiaan ja täytä se tarvittavalla määrällä vettä. Sitten niitä ravistetaan melko voimakkaasti ja vesi kaadetaan toiseen astiaan. Kangastuotteista saadaan myös sato vanupuikolla, mutta niistä leikataan etukäteen tietyn kokoisia paloja.