Moderni biologia hämmästyttää löytöjensä ainutlaatuisuudella ja laajuudella. Nykyään tämä tiede tutkii useimpia prosesseja, jotka ovat piilossa silmiltämme. Tämä on merkittävää molekyylibiologian kann alta – yksi lupaavista alueista, joka auttaa selvittämään elävän aineen monimutkaisimmat mysteerit.
Mikä on käänteinen transkriptio
Käänteistranskriptio (lyhyesti RT) on spesifinen prosessi, joka on ominaista useimmille RNA-viruksille. Sen pääominaisuus on kaksijuosteisen DNA-molekyylin synteesi, joka perustuu lähetti-RNA:han.
OT ei ole ominaista bakteereille tai eukaryoottisille organismeille. Pääentsyymillä, reversetaasilla, on avainrooli kaksijuosteisen DNA:n synteesissä.
Löytöhistoria
Ajatusta siitä, että ribonukleiinihappomolekyylistä voisi tulla DNA-synteesin malli, pidettiin absurdina 1970-luvulle asti. Sitten B altimore ja Temin, jotka työskentelivät erillään toisistaan, löysivät melkein samanaikaisesti uuden entsyymin. He kutsuivat sitä RNA-riippuvaiseksi DNA-polymeraasiksi tai käänteiskopioijaksi.
Tämän entsyymin löytö vahvisti ehdoitta organismien olemassaolonpystyvät käänteistranskriptioon. Molemmat tutkijat saivat Nobel-palkinnon vuonna 1975. Jonkin ajan kuluttua Engelhardt ehdotti käänteiskopioijalle vaihtoehtoista nimeä - revertaasi.
Miksi OT on ristiriidassa molekyylibiologian keskeisen dogman kanssa
Keskidogma on peräkkäisen proteiinisynteesin käsite missä tahansa elävässä solussa. Tällainen järjestelmä on rakennettu kolmesta komponentista: DNA, RNA ja proteiini.
Keskeisen dogman mukaan RNA voidaan syntetisoida yksinomaan DNA-templaatilla, ja vasta sitten RNA osallistuu proteiinin primäärirakenteen rakentamiseen.
Tämä dogmi hyväksyttiin virallisesti tiedeyhteisössä ennen käänteisen transkription löytämistä. Ei ole yllättävää, että tiedemiehet ovat pitkään hylänneet ajatuksen DNA:n käänteissynteesistä RNA:sta. Vasta vuonna 1970, yhdessä reversetaasin löytämisen kanssa, tämä ongelma päättyi, mikä heijastui proteiinisynteesin käsitteeseen.
Lintujen retrovirusten palautuminen
Käänteistranskriptioprosessi ei ole täydellinen ilman RNA-riippuvaisen DNA-polymeraasin osallistumista. Lintujen retroviruksen palautumista on tutkittu tähän mennessä suurimmassa määrin.
Vain noin 40 molekyyliä tätä proteiinia löytyy tämän virusperheen yhdestä virionista. Proteiini koostuu kahdesta alayksiköstä, joita on yhtä monta ja jotka suorittavat kolme tärkeää käänteistoimintoa:
1) DNA-molekyylin synteesi sekä yksijuosteisella/kaksijuosteisella RNA-templaatilla että deoksiribonukleiinihappojen perusteella.
2) RNaasi H -aktivointi, jonka päärooli onRNA-molekyylin pilkkominen RNA-DNA-kompleksissa.
3) DNA-molekyylien osien tuhoaminen eukaryoottigenomiin liittämistä varten.
Mekanismi OT
Käänteisen transkription vaiheet voivat vaihdella virusperheen mukaan, esim. niiden nukleiinihappojen tyypistä.
Mietitään ensin viruksia, jotka käyttävät reversetaasia. Tässä OT-prosessi on jaettu 3 vaiheeseen:
1) "-" RNA-juosteen synteesi RNA-juosteen templaatissa "+".
2) RNA:n "+"-juosteen tuhoaminen RNA-DNA-kompleksissa käyttämällä RNaasi H -entsyymiä.
3) Kaksijuosteisen DNA-molekyylin synteesi RNA-ketjun templaatilla "-".
Tämä virionin lisääntymismenetelmä on tyypillinen joillekin onkogeenisille viruksille ja ihmisen immuunikatovirukselle (HIV).
On syytä huomata, että minkä tahansa RNA-templaatin nukleiinihapon synteesiä varten tarvitaan siemen tai aluke. Aluke on lyhyt nukleotidisekvenssi, joka on komplementaarinen RNA-molekyylin (templaatin) 3'-päälle ja jolla on tärkeä rooli synteesin aloittamisessa.
Kun virusalkuperää olevia valmiita kaksijuosteisia DNA-molekyylejä integroidaan eukaryoottigenomiin, virioniproteiinisynteesin tavallinen mekanismi alkaa. Tämän seurauksena viruksen "vangitsemasta" solusta tulee virionin tuotantotehdas, jossa muodostuu suuria määriä tarvittavia proteiini- ja RNA-molekyylejä.
Toinen käänteistranskription tapa perustuu RNA-syntetaasin toimintaan. Tämä proteiini on aktiivinen paramyksoviruksissa, rabdoviruksissa, pikornoviruksissa. Tässä tapauksessa OT:lla ei ole kolmatta vaihetta - muodostumistakaksijuosteinen DNA, ja sen sijaan "+" RNA-ketju syntetisoidaan viruksen "-" RNA-ketjun templaatille ja päinvastoin.
Tällaisten syklien toistuminen johtaa sekä virusgenomin replikaatioon että sellaisen mRNA:n muodostumiseen, joka kykenee proteiinisynteesiin infektoituneen eukaryoottisolun olosuhteissa.
Käänteistranskription biologinen merkitys
OT-prosessi on äärimmäisen tärkeä monien virusten (ensisijaisesti retrovirusten, kuten HIV:n) elinkaaressa. Eukaryoottisolua vastaan hyökänneen virionin RNA:sta tulee templaatti ensimmäisen DNA-juosteen synteesille, jolla toisen juosteen saaminen valmiiksi ei ole vaikeaa.
Saadun viruksen kaksijuosteinen DNA integroituu eukaryoottigenomiin, mikä johtaa virioniproteiinisynteesin prosessien aktivoitumiseen ja suuren määrän sen kopioita ilmaantumiseen infektoituneen solun sisään. Tämä on Revertasen ja yleensä OT:n päätehtävä virukselle.
Käänteistranskriptio voi tapahtua myös eukaryooteissa retrotransposonien yhteydessä – liikkuvien geneettisten elementtien yhteydessä, jotka voivat itsenäisesti kulkeutua genomin osasta toiseen. Sellaiset elementit aiheuttivat tutkijoiden mukaan elävien organismien evoluution.
Retrotransposoni on osa eukaryoottista DNA:ta, joka koodaa useita proteiineja. Yksi niistä, reversetaasi, on suoraan osallisena tällaisen retrotransporotsonin siirtämisessä.
OT:n käyttö tieteessä
Siitä lähtien, kun reversetaasi eristettiin puhtaassa muodossaan, biologit ovat omaksuneet käänteistranskriptioprosessin. OT-mekanismin tutkiminen auttaa edelleen lukemaan tärkeimpien ihmisen proteiinien sekvenssit.
Tosiasia on, että eukaryoottien genomi, mukaan lukien meidän, sisältää ei-informatiivisia alueita, joita kutsutaan introneiksi. Kun tällaisesta DNA:sta luetaan nukleotidisekvenssi ja muodostuu yksijuosteinen RNA, jälkimmäinen menettää intronit ja koodaa yksinomaan proteiinia. Jos DNA syntetisoidaan käyttämällä reversetaasia RNA-templaatissa, se on helppo sekvensoida ja selvittää nukleotidien järjestys.
Käänteiskopioijaentsyymin muodostamaa nukleiinihappoa kutsutaan cDNA:ksi. Sitä käytetään usein polymeraasiketjureaktiossa (PCR) lisäämään keinotekoisesti tuloksena olevan cDNA-kopion kopiolukua. Tätä menetelmää ei käytetä vain tieteessä, vaan myös lääketieteessä: laboratorioavustajat määrittävät tällaisen DNA:n samank altaisuuden eri bakteerien tai virusten genomien kanssa yhteisestä kirjastosta. Vektorien synteesi ja niiden vieminen bakteereihin on yksi lupaavista biologian alueista. Jos RT:tä käytetään ihmisten ja muiden organismien DNA:n muodostamiseen ilman introneja, tällaisia molekyylejä voidaan helposti viedä bakteerien genomiin. Jälkimmäisistä tulee siis tehtaita, jotka tuottavat ihmiselle välttämättömiä aineita (esimerkiksi entsyymejä).
