Mikä on DNA-hybridisaation taustalla? Vaikka kaksijuosteinen DNA-sekvenssi on yleensä stabiili fysiologisissa olosuhteissa, näiden olosuhteiden muuttaminen laboratoriossa (tyypillisesti nostamalla ympäristön lämpötilaa) saa molekyylit erottumaan yksittäisiksi juosteiksi. Jälkimmäiset täydentävät toisiaan, mutta voivat myös täydentää muita ympäristössään olevia sekvenssejä. Ympäristön lämpötilan alentaminen mahdollistaa yksijuosteisten molekyylien pariutumisen tai "hybridisoitumisen" toistensa kanssa. Tämä on DNA-hybridisaatiomenetelmä.
Konsepti molekyylibiologian näkökulmasta
Sekä DNA:n replikaatioon että DNA:n transkriptioon RNA:ksi osallistuvat tutkijat luottavat nukleotidien risteykseen ja molekyylibiologian tekniikoihin. Tämä sisältää Southern- ja Northern-blotit, polymeraasiketjureaktion (PCR) ja useimmat DNA-RNA-hybridisaatio- ja sekvensointimenetelmät.
Hakemus
Hybridisaatio on nukleotidin tärkein ominaisuussekvenssit ja sitä käytetään lukuisissa molekyylibiologian menetelmissä. Kahden lajin yleinen geneettinen suhde voidaan määrittää hybridisoimalla niiden DNA-segmenttejä (DNA-DNA-hybridisaatio). Lähisukuisten organismien välisten sekvenssien samank altaisuuksien vuoksi tällaisten DNA-hybridien sulattamiseen tarvitaan korkeampi lämpötila verrattuna kaukaisempiin organismeihin. Useat menetelmät käyttävät hybridisaatiota DNA-näytteen alkuperän määrittämiseen, mukaan lukien polymeraasiketjureaktio (PCR). Toisessa menetelmässä lyhyet DNA-sekvenssit hybridisoidaan solun mRNA:han ekspressoituneiden geenien tunnistamiseksi. Lääkeyhtiöt tutkivat antisense-RNA:n käyttöä ei-toivottuun mRNA:han sitoutumiseen, mikä estää ribosomia muuntamasta mRNA:ta proteiiniksi.
DNA-DNA-hybridisaatio viittaa yleensä molekyylibiologian tekniikkaan, joka mittaa DNA-sekvenssipoolien välisen geneettisen samank altaisuuden astetta. Sitä käytetään yleisesti määrittämään kahden organismin välinen geneettinen etäisyys. Sitä on käytetty laaj alti fysiologiassa ja taksonomiassa.
Metodologia
Yhdestä organismista peräisin oleva DNA leimattiin ja sekoitettiin sitten leimaamattoman DNA:n kanssa, jota voitiin verrata siihen. Seosta inkuboidaan, jotta DNA-säikeet voivat dissosioitua ja sitten jäähtyä, jolloin muodostuu regeneroitu kaksijuosteinen hybridi-DNA. Hybridisoidut sekvenssit, joilla on suuri samank altaisuus, sitoutuvat tiukemmin ja vaativat enemmän energiaa erottaakseen ne: eli ne erottuvat, kun niitä kuumennetaan korkeammallalämpötilassa kuin erilaiset sekvenssit, prosessi, joka tunnetaan nimellä "DNA-sulatus".
DNA sulaa
Arvioitaessa hybridisoituneen DNA:n sulamisprofiilia, kaksijuosteinen DNA sidotaan niin kutsuttuun "kolonniin" ja tuloksena olevaa seosta kuumennetaan. Jokaisessa vaiheessa pylväs pestään ja sulavat DNA-sekvenssit muuttuvat yksijuosteisiksi ja pestään pois kolonnista. Lämpötilat, joissa leimattu DNA poistuu kolonnista, kuvastavat sekvenssien välisen samank altaisuuden määrää (ja itselaskostuva kuvio toimii kontrollina). Nämä tulokset yhdistetään organismien geneettisen samank altaisuuden asteen määrittämiseksi. Nykyajan mikrobiologian mukaan DNA-hybridisaatio on mahdotonta ilman näiden asioiden ymmärtämistä.
Kun useita ribonukleiinihappo (tai deoksiribonukleiini) happolajeja verrataan tällä tavalla, samank altaisuusarvot sallivat lajin sijoittamisen fylogeneettiseen puuhun. Siksi tämä on yksi mahdollisista lähestymistavoista molekyylien systematiikan suorittamiseksi. Tämän tekniikan pioneerit Charles Sibley ja John Ahlquist käyttivät DNA-DNA-hybridisaatiota lintujen (Sibley-Ahlquistin taksonomia) ja kädellisten fylogeneettisten suhteiden tutkimiseen.
Biologian tärkeys
DNA-DNA-hybridisaatio on kultastandardi bakteerilajien erottamisessa, ja samank altaisuusarvo on yli 70 %, mikä osoittaa, että verratut kannat kuuluvat eri lajeihin. Vuonna 2014 ehdotettiin 79 %:n samank altaisuuden kynnystä bakteerien alalajin erottamiselle.
Kriitikot väittävät, että tekniikka on epätarkka lähisukulaisten lajien vertaamiseen, koska kaikki yritykset mitata ortologisten sekvenssien välisiä eroja organismin genomissa ovat ylikuormitettuja paralogisten vastineiden hybridisoituessa organismin genomiin. DNA-sekvensointi ja laskennalliset sekvenssivertailut ovat tällä hetkellä yleisesti käytetty menetelmä geneettisen etäisyyden määrittämiseen, vaikka tätä lähestymistapaa käytetään edelleen mikrobiologiassa bakteerien tunnistamisessa.
Nykyinen tapa on suorittaa DNA-DNA-hybridisaatio silikonissa käyttämällä täysin tai osittain sekvensoituja genomeja. DSMZ:n kehittämä GGDC on tarkin tunnettu työkalu DDH:n k altaisten arvojen laskemiseen. Muiden algoritmisten parannusten ohella se ratkaisee paralogisten sekvenssien ongelman suodattamalla ne huolellisesti kahden genomisekvenssin välisistä vastaavuuksista.
KALAmenetelmä
Fluorescence In Situ -hybridisaatio (FISH) on laboratoriotekniikka, jota käytetään havaitsemaan ja sekvensoimaan DNA, usein tietyssä kromosomissa.
Vuonna 1969 Joseph Gall ja Mary Lou Pardu julkaisivat paperin, joka osoitti, että ribosomaalisen DNA-sekvenssin radioaktiivisia kopioita voidaan käyttää komplementaaristen DNA-sekvenssien havaitsemiseen sammakonmunan ytimestä. Näiden alkuperäisten havaintojen jälkeen monet parannukset ovat lisänneet monipuolisuutta jatoimenpiteen herkkyys siinä määrin, että in situ -hybridisaatiota ("paikallaan", latinaksi) pidetään nykyään tärkeänä sytogenetiikan työkaluna. (Termiä in situ käytetään nykyään myös viittaamaan karsinooman kasvun alkuvaiheeseen, jolloin patologiseen prosessiin osallistuu vain epiteelikudos.)
Fluoresoiva hybridisaatiosekvenssi
RNA-koettimet voidaan suunnitella mille tahansa geenille tai mille tahansa geenin sekvenssille lncRNA- ja miRNA-mRNA:n visualisoimiseksi kudoksissa ja soluissa. FISH:ia käytetään tutkittaessa solujen lisääntymissykliä, erityisesti tuman välistä vaihetta kromosomipoikkeavuuksien var alta. FISHin avulla voit analysoida suuren joukon arkistoituja tapauksia, on paljon helpompi tunnistaa tunnistettu kromosomi luomalla koetin, jossa on keinotekoinen kromosomipohja, joka houkuttelee samanlaisia kromosomeja.
Hybridisaatiosignaalit jokaiselle koettimelle, kun tumapoikkeavuus havaitaan: jokainen mRNA- ja lncRNA-detektiokoetin koostuu 20 parista oligonukleotideja, kukin pari kattaa 40-50 bp:n tilan. p. Koettimet käyttävät patentoitua kemiaa mRNA:n havaitsemiseen.
Hybridisaatio DNA-koettimilla
Koettimet valmistetaan usein DNA-fragmenteista, jotka on eristetty, puhdistettu ja monistettu käytettäväksi ihmisen genomin suunnittelussa. Ihmisen genomin koko on niin suuri verrattuna pituuteen, joka voidaan suoraan sekvensoida, että se on tarpeen jakaafragmentteja. Lopulta nämä fragmentit järjestettiin pilkkomalla kunkin fragmentin kopio vielä pienemmiksi yksiköiksi käyttämällä sekvenssispesifisiä endonukleaaseja kunkin pienen fragmentin koon mittaamiseksi käyttämällä kokoekskluusiokromatografiaa käyttämällä näitä tietoja sen määrittämiseksi, missä suuret fragmentit limittyivät toistensa kanssa.
Elementtien ja niiden yksittäisten DNA-sekvenssien säilyttämiseksi fragmentit lisättiin jatkuvasti toistuvien bakteeripopulaatioiden järjestelmään. Bakteerien kloonaalisia populaatioita, joissa jokaisella populaatiolla on yksi keinotekoinen kromosomi, säilytetään useissa laboratorioissa ympäri maailmaa. Keinotekoisia kromosomeja (BAC) voidaan kasvattaa, uuttaa ja leimata missä tahansa kirjaston sisältävässä laboratoriossa. Genomikirjastot on usein nimetty niiden instituutioiden mukaan, joissa ne on kehitetty. Esimerkki on RPCI-11-kirjasto, joka on nimetty Buffalossa (New York, USA) sijaitsevan Roswell Cancer Instituten mukaan. Nämä fragmentit muodostavat noin 100 tuhatta emäsparia ja ovat useimpien FISH-koettimien perusta.
