Enterobakteerien ja joidenkin vibrioiden differentiaalisessa määrittämisessä Voges-Proskauer-reaktiolla on erityinen paikka. Testi perustuu bakteerien kykyyn fermentoida glukoosia asetoiiniksi.
Tutkimusprosessin ydin
Mikrobiologiassa Voges-Proskauer-reaktiota käytetään usein Yersinia-perheen enterobakteerien (mukaan lukien pseudotuberkuloosin ja enterokoliitin patogeenit), Escherichia colin ja itiöitä muodostavien aerobien erottamiseen. Tulos visualisoidaan värjäämällä väliaine, kun tiettyjä reagensseja lisätään.
Tämä testi kuuluu IMViC-sarjaan (lyhenne sanoista Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate).
- indolin kanssa, perustuu tryptofaanin hajoamiseen indoliksi, käytetään Kovacs- tai Ehrlich-reagenssin läsnä ollessa;
- käyttäenmetyyliroth tai metyylipuna, joka havaitsee tietyn pH:n glukoosin metabolaation seurauksena;
- Voges-Proskauerin reaktiot asetyylimetyylikarbinolin havaitsemiseen;
- sitraatin käyttö ja värinmuutos väliaineen alkalisoinnin seurauksena.
Prosessin ydin on diagnosoitujen bakteerien läsnäolon visualisointi, joka johtuu niiden muodostaman asetoiinin vuorovaikutuksesta emäksisen potaskan kanssa hapen läsnä ollessa. Asetyylimetyylikarbinoli hapettuu diasetyyliksi, joka muodostaa kirkkaan punaisen tai vaaleanpunaisen yhdisteen. Lisää testin herkkyyttä lisäämällä alfanaftolia ennen kuin lisäät emäksistä potaskaa.
Testiasetus
Voges-Proskauer-reaktion formulointiin sisältyy mikro-organismien esiviljely. Puhdas viljelmä kylvetään Clarkin differentiaalidiagnostiselle alustalle, jonka muunnelma on Clarkin liemi (ilman agar-agarin lisäystä). Käytetään joko valmista väliainetta tai valmistetaan itsenäisesti. Ainekset sisältävät:
- 5g peptonia;
- 5g glukoosia;
- 5g kaksiemäksistä kaliumfosfaattia;
- 1L tisle.
Tutkimuksen aikana viljelmä siirrostetaan steriilillä bakteriologisella silmukalla nestemäiseen väliaineeseen. Määrä - 5 ml koeputkessa plus kontrolli. Inkubointi suoritetaan 35-37 asteen lämpötilassa kahden päivän ajan. Seuraavaksi Voges-Proskauer-reaktion tutkimus suoritetaan vaiheittain:
- 2, 5 ml liemiviljelmää siirretään steriiliin putkeen.
- Lisää kuusi tippaa alfanaftolia (5 % alkoholiliuosta).
- Lisää 40 %kaustista kaliumliuosta 0,1 ml tai kaksi tippaa.
- Sekoitus suoritetaan ravistamalla koeputkea kevyesti.
- Arvioi tulos 15 minuutin kuluttua kokeen alusta.
Vaihtoehtoinen testimenetelmä on yli yön inkubointi, jonka aika lyhennetään 18 tuntiin tai jopa vuorokauteen. Tämän menetelmän lisäksi käytetään myös express-testiä: viljelmä viedään silmukassa 2 ml:aan alustaa, inkuboidaan noin neljä tuntia, sitten lisätään reagensseja yhtä suurena määränä 2-3 tippaa, sekoitetaan ja tulos arvioidaan kymmenen minuutin kuluttua.
Vertailu on yksi keuhkokuumeen aiheuttajista Klebsiella pneumoniae - kanta atcc 13883.
Tulosten arviointi
Reagenssien lisäämisen jälkeen vaaditun ajan (5-15 minuuttia) jälkeen kirsikanpunainen väri tulee havaita selvästi positiivisella reaktiolla, punainen ja vaaleanpunainen - heikosti positiivisella reaktiolla. Muutosta ei kirjata negatiiviseksi tulokseksi.
Liika emäksinen potaska liuoksessa voi jäljitellä positiivista reaktiota ja värjäytyä kuparinväriseksi. Tässä tapauksessa testatun pesäkkeen negatiivinen vaste on kirjattava. Kuparin värjäytymistä esiintyy myös tapauksissa, joissa arviointi annetaan tunnin kuluttua reagenssien lisäämisestä.
Tulosta arvioitaessa on otettava huomioon, että tutkittujen mikro-organismien pitkittynyt viljely (yli kolme päivää) johtaa alustan happamoittamiseen, mikä voi johtaa virheelliseen tutkimustulokseen. Reaktio voi olla lievästi positiivinen taiväärä negatiivinen.
Testireagensseja koskevat vaatimukset
Voges-Proskauer-reagenssien on täytettävä vaatimukset, kuten oikea konsentraatio, korkea puhtaus ja stabiilisuus, mikä saavutetaan asianmukaisella säilytyksellä.
Käyttövalmiit testisarjat sisältävät yleensä reagensseja vähintään 100 käyttötarkoitukseen, ja ne toimitetaan muovi- tai sävytetyissä lasipulloissa. Laatua säätelevät asiaankuuluvat asiakirjat.
