Gram-värjäystä käytetään laaj alti mikrobiologiassa, koska se on yksi helpoimmista tavoista erottaa bakteerit niiden soluseinän koostumuksen perusteella. Gramin mukaan kaikki bakteerit voidaan jakaa grampositiivisiin (Gram (+)) ja gramnegatiivisiin (Gram (-)). Gram-värjäysmenetelmä kehitettiin vuonna 1884, eikä se ole sen jälkeen menettänyt suosiotaan, vaikka sitä on muutettu useita kertoja.
Soluseinärakenne
Gramvärjäys paljastaa, onko bakteeri grampositiivinen vai gramnegatiivinen. Bakteerien jakautuminen grammiin (+) ja grammiin (-) tapahtuu niiden soluseinän rakenteen mukaisesti.
Soluseinä sisältää suurimman määrän peptidoglykaania (mureiinia) - monimutkaista ainetta, joka sisältää peptapeptidiä ja glykaania. Glykaani koostuu vuorottelevista N-asetyyliglukosamiinin ja N-asetyylimuramiinihapon tähteistä, jotka ovat liittyneet toisiinsa β-1:llä,4-glykosidisidokset. Peptidoglykaani ylläpitää solun muotoa, suojaa osmoottista ja toimii antigeenisenä.
Tärkeimmät erot grampositiivisten ja gramnegatiivisten bakteerien välillä
Eri bakteereilla on eri peptidoglykaanikerroksen paksuus. Gram-positiivisiksi luokitelluissa bakteereissa se on 15-80 nm, kun taas gram-negatiivisissa se on 2-8 nm. Samaan aikaan gramnegatiivisilla bakteereilla on erityinen rakenne peptidoglykaanikerroksen alla, jota grampositiivisilla bakteereilla ei ole - periplasminen tila. Tämä tila on täynnä hydrolyyttisiä entsyymejä - β-laktamaasi, ribonukleaasi 1, fosfataasi. Nämä entsyymit ovat vastuussa gramnegatiivisten bakteerien vastustuskyvystä monille antibiooteille.
Bakteereiden Gram(-)-peptidoglykaanikerros on sitoutunut lipopolysakkaridiin, endotoksiinia sisältävään antigeeniseen rakenteeseen. Gram(+)-bakteereissa teikoiinihapot suorittavat samanlaisia tehtäviä.
Gram-negatiivisilla bakteereilla on lisärakenne - ulkokalvo.
Värjäysmenetelmän ydin
Ennen kuin aloitat värjäyksen, tutkituista bakteereista valmistetaan sivelynäytteitä. Tätä varten lasilevylle tiputetaan vettä ja siihen lisätään mikro-organismiviljelmä bakteerisilmukalla. Sitten, kun vesi on täysin kuivunut, sively kiinnitetään - lasilevyä kuljetetaan useita kertoja polttimen liekin yli. Gramvärjäys on tehokkaampaa kuin elävien bakteerien värjäys – väriainemolekyylit sitoutuvat paremmin kuolleisiin soluihin.
Väritys tehdään useissa vaiheissa:
- Pienet suodatinpaperin palaset asetetaan kiinteälle leville ja pääväriaine kaadetaan - gentianvioletti tai metyleenisininen.
- Poista värillinen suodatinpaperi 3-5 minuutin kuluttua ja täytä sively Lugolin liuoksella 1 minuutin ajan. Tässä tapauksessa valmiste tummuu.
- Lugol-liuos valutetaan ja sivelee käsitellään puhtaalla etyylialkoholilla: valmisteelle tiputetaan muutama tippa, valutetaan 20 sekunnin kuluttua. Toimenpide toistetaan 2-3 kertaa.
- Huuhtele testilasi tislatulla vedellä.
- Tuota lisävärjäystä - viimeistele valmistelu fuksiinilla. 1-2 minuutin kuluttua väriaine pestään pois.
- Kun vesi on kuivunut, tutki sivelyä mikroskoopilla. Grampositiiviset bakteerit ovat sinivioletteja, gramnegatiiviset bakteerit ovat vaaleanpunaisia tai punaisia.
Erilaisten värjäytymiskuvioiden syyt
Kuten edellä on kuvattu, bakteerien gramvärjäys värjää grampositiiviset bakteerit siniviolettiksi, kun taas gramnegatiiviset bakteerit värjäävät punaisia tai vaaleanpunaisia. Syy bakteerien erilaiseen värjäytymiseen tällä menetelmällä on se, että gentianviolettin liukenevan muodon tultua soluun väriaine siirtyy liukenemattomaan jodimuotoon. Kun bakteereita käsitellään etyylialkoholilla, lipidit uutetaan kalvosta tämän ei-polaarisen liuottimen vaikutuksesta. Kalvo muuttuu sitten huokoiseksi eikä ole enää merkittävä este väriaineen huuhtoutumiselle. kuitenkinpeptidoglykaani on kestävämpi ei-polaarisille liuottimille, mukaan lukien alkoholi. Hän on se, joka estää väriaineen huuhtoutumisen pois, jolloin paksun mureiinikerroksen omaavat bakteerit muuttuvat sinivioletteiksi (gram-positiivisiksi), eivätkä alkoholikäsittelyn jälkeen muuta väriään.
Gram-negatiivisten bakteerien ohut mureiinikerros ei pysty pitämään väriainemolekyylejä solussa, joten alkoholin vaikutuksesta ne muuttuvat värittömiksi - värjäytyvät gramnegatiivisiksi.
Fuksiinille altistumisen jälkeen Gram-värjäytyneet bakteerit pysyvät sinivioleteina, kun taas gramnegatiiviset bakteerit muuttuvat vaaleanpunaisen punaisiksi.
Esimerkkejä Gram(+)- ja Gram(-)-bakteereista
Gramnegatiivisia bakteereja ovat syanobakteerit, rikkibakteerit, rautabakteerit, klamydia, riketsia, etikkabakteerit, monet metylobakteereista, tionibakteerit, arsenitobakteerit, karboksibakteerit.
Bifidobakteerit, monet vesibakteerit, streptokokit ja stafylokokit ovat grampositiivisia.
